Somit sind die biologischen Toxine nicht nur in staatlichen Biowaffenprogrammen, wie z. B. dem des Irak unter Saddam Hussein, bearbeitet worden, sondern werden auch immer wieder in der terroristischen Szene als Anschlagsmittel betrachtet. Hier seien als Beispiel aus den letzten Jahren Rizin-haltige Briefe genannt, die an den amerikanischen Präsidenten Obama verschickt wurden. In Europa, unter anderem auch in Köln, wurden mehrfach Täter aus dem islamistischen Spektrum aufgegriffen, die versuchten, Rizin herzustellen. Diese Beispiele zeigen, wie real die Bedrohung im Zusammenhang mit diesen Agenzien ist.
Abb. 1: Schematischer Ablauf des On-Bead ELISA zum Nachweis des Rizins
Nach Vorbereitung der Probe wird diese mit magnetischen Beads präabsorbiert um ggf. vorhandene Antikörper
zu eliminieren. Anschließend wird ein monoklonaler Antikörper gegen Rizin mit der Probe versetzt, der das
Toxin bindet. Die entstandenen Rizin-Antikörper-Komplexe werden durch magnetische Partikel gebunden. Das
so gebundene Rizin wird mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper markiert und mittels Substratumschlag
nachgewiesen. Mit Hilfe eines Standard ELISA Readers ist eine semiquantitative Bestimmung möglich.
Aus (wehr-) medizinischer Sicht weisen Bio-Toxine einige Besonderheiten auf, die die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie erschweren. Anders als bakterielle oder virale Krankheitserreger vermehren sie sich nicht im Patienten. Ihre Wirkung setzt bereits binnen weniger Stunden nach Aufnahme in den Körper ein. Darüber hinaus sind sie für eine Neutralisation durch Therapeutika meist nur erreichbar, so lange sie noch nicht in die Zielzellen aufgenommen wurden, wodurch das Zeitfenster für therapeutische Interventionen sehr kurz ist. Dies stellt diagnostische Verfahren vor die Herausforderung, dass sie nicht nur höchst sensitiv und spezifisch sein müssen, sondern auch nach kurzer Zeit bereits ein Ergebnis liefern müssen. Erschwert wird die Situation noch dadurch, dass die krankmachende Wirkung, anders als bei Bakterien und Viren, losgelöst ist von der Erbinformation. Somit können Nukleinsäure-Nachweise mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nur bedingt eingesetzt werden. Im positiven Fall zeigen sie zwar an, dass ein Toxin-produzierender Organismus anwesend ist, im negativen Fall ist eine sichere Aussage über die Abwesenheit des Toxins jedoch nicht möglich.
Aktuelle Entwicklungen in der Toxindiagnostik am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (IMB) beruhen deshalb zum einen auf dem immunologischen Nachweis des Toxins, z. B. mittels ELISA, oder auf dem Nachweis seiner Funktion oder auf einer Kombination aus beiden.
Als Beispiel für den immunologischen Nachweis ist hier die Detektion von Rizin mittels On-Bead-ELISA dargestellt Hier wird der Analyt Rizin mit monoklonalen Antikörpern, die an magnetische Partikel gebunden sind, aus der Probenmatrix angereichert. Anschließend erfolgt der Nachweis des Rizins durch Bindung an einen zweiten, Enzym-gekoppelten Antikörper und den Nachweis des Substratumsatzes durch das Enzym. So wird eine hohe Sensitivität und Robustheit gegenüber Matrixeffekten des Testsystems gewährleistet. Mit diesem System kann Rizin nicht nur in klinischem Probenmaterial, wie z. B. Plasma, nachgewiesen werden, sondern auch komplexe Matrices wie Nahrungsmittel-, Stuhl- oder Umgebungsproben können untersucht werden. Darüber hinaus wurde das System so konzipiert, dass es mit Standard-Laborequipment durchgeführt werden kann. Neben einem Magnetstand und Pipetten wird nur ein ELISA-Reader benötigt. Dies macht den Einsatz in nicht speziell ausgerüsteten Laboren und vor allem auch in mobilen Laboreinrichtungen, wie sie z. B. im Rahmen der mobilen B-Aufklärung genutzt werden, möglich.
Abb. 2: Schematischer Ablauf der immunomagnetischen Anreicherung von BoNT mit anschließendem Nachweis
der Proteaseaktivität
Magnetische Partikel werden mit BoNT-spezifischen Antikörpern beschichtet und anschließend mit der Probe
versetzt um enthaltenes Toxin an die Partikel zu binden. Nach dem Waschen der Partikel wird das gebundene
BoNt von diesen gelöst und in seine Untereinheiten, die schwere Kette und die enzymatisch aktive leichte
Kette,
gespalten. Der hieraus resultierenden Lösung wird ein Peptidsubstrat zugesetzt, das von der leichten
Kette proteolytisch gespalten wird. Durch diese Spaltung werden ein Fluorochrom und ein Quencher räumlich
voneinander getrennt, so dass das vom Fluorochrom ausgestrahlte Licht gemessen werden kann. Die Lichtmenge
ist hierbei proportional zur Menge des gespaltenen Peptides und so der in der Probe enthaltenen Menge
des BoNT.
Eine Kombination aus Affinitätsanreicherung und funktionalem Test befindet sich für die BoNT im Aufbau. Die Wirkung dieser Toxine beruht auf der Spaltung von Proteinen innerhalb der Nervenzelle, wodurch die Ausschüttung von Neurotransmittern unterbunden wird und es somit zu einer schlaffen Lähmung kommt. Diese Spaltung wird in dem Testsystem nachempfunden, indem Peptide, die die spezifische Spaltstelle der Substratproteine der BoNT nachbilden, mit der Probe versetzt werden. Bei Anwesenheit von BoNT ist das Resultat der Spaltung die Freisetzung von Licht (Abb. 2). Da diese Reaktion sehr empfindlich auf störende Fakoren in der Untersuchungsmatrix reagiert und um die Spezifität und Sensitivität des Testsystems noch zu erhöhen, wird der Reaktion eine Anreicherung des BoNT mit Hilfe von magnetischen Partikeln vorangestellt, wie in Abb. 2 zu sehen ist. Auch beim Aufbau dieses Assays wird großer Wert auf die Durchführung mit einfachem Equipment gelegt. Der Nachweis der Spaltung ist mit Hilfe der Massenspektrometrie zwar mit einer höheren Spezifität möglich, jedoch ist diese Technologie noch Speziallaboren vorbehalten und für den Einsatz im Feld untauglich. Der hier gewählte Ansatz für den Nachweis der Enzymaktivität über die Spaltungs-abhängige Freisetzung von Licht wurde so konzipiert, dass er in jedem Gerät für die quantitative PCR möglich ist. Hierdurch soll wiederum eine breite Einsetzbarkeit einschließlich einer Verwendung in mobilen Laboreinrichtungen gewährleistet werden.
Fazit: Biologische Toxine sind mit einem hohen Risiko assoziiert, sowohl im Rahmen internationaler Konflikte als auch aus dem terroristischen Spektrum heraus als biologische Kampfstoffe eingesetzt zu werden. Ihr schneller, spezifischer und sensitiver Nachweis ist daher von hoher wehrmedizinischer Relevanz. Am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr wird darüber hinaus großer Wert auf die Entwicklung von Methoden gelegt, die mit einfachem Laborequipment durchführbar sind, um auch einen feldtauglichen Einsatz in mobilen Laborinfrastrukturen gewährleisten zu können.
Verfasser:
Oberfeldveterinär Dr. med. vet. Heiner von Buttlar
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
Neuherbergstrasse 11
80937 München
E-Mail: [email protected]
Datum: 28.10.2019
Quelle: Wehrmedizin und Wehrpharmazie 3/2019
