NEUE BEFUNDE UND THERAPEUTISCHE ANSÄTZE BEI WUNDHEILUNGSSTÖRUNGEN NACH S-LOST-VERGIFTUNGEN

New Findings and Therapeutic Approaches on Wound Healing after Sulfur Mustard Poisoning



Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, München (Leiter: Oberstarzt Priv.-Doz. Dr. med. H. Thiermann)



Annette Schmidt, Horst Thiermann und Dirk Steinritz

Schwefel (S)-Lost ist ein chemischer Kampfstoff, der im Ersten Weltkrieg und im Iran-Irak-Krieg (1983-88) zum Einsatz kam. Eine Exposition mit Lost führt neben der Schädigung der Lunge und der Augen zu schlecht heilenden Wunden, deren Genesung sehr langwierig ist.

Diese Wundheilungen sind Gegenstand verschiedener Projekte am Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr mit zivilen Forschungspartnern. Nach einer S-Lost-Exposition kommen bei der Wundheilung der Gefäßentwicklung und den Keratinozyten eine besondere Bedeutung zu. Letztere bilden die basale Schicht, die sich unter der S-Lost-Einwirkung ablöst. Dies führt zur Lost-induzierten Blasenbildung der Haut.

Methoden:

Am Modell differenzierter embryonaler Stammzellen wurde der Einfluss von SLost beziehungsweise S-Lost in Kombination mit den Radikalenfängern N-Acetylcystein (NAC) und alpha-Linolensäure (ALA) auf die Gefäßentwicklung durch Bestimmung der Anzahl der Gefäße, der Proliferation, der Apoptose und der Migration untersucht. Die Reifung von Keratinozyten wurde über den mRNA-Gehalt für Keratin-1, Involucrin und Loricrin in primären Keratinozyten mittels PCR bestimmt. Der Zusammenhang mit den beiden MAP-Kinasen ERK1/2 und p38 wurde mit Hilfe der entsprechenden Antikörper und den Inhibitoren PD98059 und SB203580 untersucht.

Ergebnisse:

Es zeigte sich unter dem Einfluss von S-Lost eine deutliche Schädigung der Gefäße, die auch durch die Radikalenfänger NAC und ALA nicht dauerhaft reduziert werden konnte. Die Migration der Endothelzellen wurde durch S-Lost signifikant reduziert. Schlussfolgerungen: NAC und ALA zeigten einen zeitlich begrenzten verbesserten Effekt auf die Gefäße nach einer S-Lost-Schädigung. SLost stimuliert die Differenzierung von unreifen Keratinozyten über die Aktivität von p38, was ein Grund für die verzögerte Heilung von SLost induzierten Wunden darstellen könnte.

Summary

Background:

Sulfur mustard (SM) is a chemical warfare agent. An exposure with SM leads to an impairment of the lungs, the eyes and poorly healing wounds. This wound healing is the subject of several projects at the Institute of Pharmacology and Toxicology of the Bundeswehr with external research partners. After a SM-exposure vascular development and keratinocyte are of particular importance. The latter form the basal layer, which detaches itself under the SM-exposure. This leads to the SM-induced blistering of the skin.

Methods:

The model of differentiated embryonic stem cells was investigated to analyse the influence of SM on vascular development. Here the number of vessels, proliferation, apoptosis and migration under influence of SM or SM in combination with the radical scavengers N-acetylcysteine (NAC) and alpha-linoleic acid (ALA) respectively was considered. To study the maturation of primary keratinocytes the mRNA content of keratin 1, involucrin and loricrin was examined by PCR. The relationship with the two MAP kinases ERK1/2 and p38 was investigated using the appropriate antibodies or the inhibitors PD98059 and SB203580.

Results:

There was a significant reduction of the vessels under influence of SM, even by the radical scavenger NAC and ALA could not be permanently reduced. The migration of endothelial cells was significantly reduced. Conclusions: The radical scavenger NAC and ALA show a temporary improving effect on the blood vessels after SM injury. SM stimulates the differentiation of immature keratinocytes by the activity of p38, which could be a reason for the delayed recovery of SM-induced wounds.

Keywords:

Chemical warfare agent, blistering agents, SM, wound healing

1. Einleitung

Chemische Kampfstoffe (C-Kampfstoffe) sind Giftstoffe, die zum Zweck der chemischen Kriegsführung produziert werden. Ziel des Einsatzes von CKampfstoffen ist es, den Gegner temporär handlungsunfähig zu machen, eine Dauerschädigung zu bewirken oder sogar zu töten. C-Kampfstoffe wurden im militärischen Bereich in der Vergangenheit in Raketen, Bomben und Granaten verfüllt. Jedoch ist auch eine Ausbringung durch Agrar-Flugzeugen, Gartenspritzen, Druckbehälter oder Klimaanlagen denkbar.

Chemische Kampfstoffe können in verschiedene Gruppen untergliedert werden wie zum Beispiel Nerven-, Haut-, Blut-, Lungen-, Nasen-Rachen-, Augenund Psychokampfstoffe. Streng wissenschaftlich gesehen, ist diese Gliederung jedoch inkonsistent, da beispielsweise Hautkampfstoffe auch eine Schädigung der Lunge oder der Augen hervorrufen können. Neben den Nervenkampfstoffen spielen die Hautkampfstoffe eine entscheidende Rolle. Der Hautkampfstoff mit der höchsten militärischen Relevanz ist Schwefel-Lost, kurz

S-Lost. Synonyme für S-Lost sind: Gelbkreuz, Senfgas, Yperit und HD. S-Lost ist ein alkylierender chemischer Kampfstoff, der in verunreinigter Form einen knoblauch- oder senfartigen Geruch aufweist, in reiner Form jedoch geruchslos ist. 1822 wurde S-Lost zum ersten Mal durch den Chemiker Despretz synthetisiert [1]. Hierbei entstand S-Lost jedoch zufällig und wurde wegen seines stechenden Geruchs nicht weiter verfolgt. 1860 wurde SLost erneut synthetisiert und durch Gustrie und Niemann chemisch beschrieben [2]. Anfang des 20. Jahrhunderts wurde Lost dann durch die beiden Chemiker Lommel und Steinkopf im Labor von Fritz Haber weiterentwickelt und gezielt synthetisiert [2]. Startpunkt der chemischen Kriegsführung war der Erste Weltkrieg, als erstmals Chlorgas und S-Lost zum Einsatz kamen. S-Lost wurde von deutschen Truppen am 12. Juli 1917 bei Ypern ausgebracht (davon abgeleitet die Bezeichnung Yperit). Auch im Zweiten Weltkrieg wurde SLost produziert und gelagert, jedoch nicht genutzt [2]. Nach dem Zweiten Weltkrieg wurden die deutschen Bestände an C-Kampfstoffen vor allem in der Ostsee verklappt [3]. Allein nahe der Insel Bornholm wurden etwa 11 000 t, davon über 7 000 t S-Lost, versenkt [3].

Der militärische Einsatz von S-Lost erfolgte zuletzt im Iran-Irak-Krieg (1983- 1988), unter anderem 1988 gegen die von Kurden bewohnte nordirakische Stadt Halabdscha, und während der Iran-internen Konflikte [2].

Eine Exposition mit S-Lost ist selten tödlich, verursacht aber schwere Haut-, Augen- und Atemwegschäden, deren Heilung sich über Monate hinziehen kann. Zunächst kommt es zu starken Entzündungen, die sich in deutlichen Rötungen der Haut widerspiegeln. Nachfolgend treten Blasen an der Haut auf, die mit Flüssigkeit gefüllt sind. Die Therapie von Patienten mit klinisch manifesten Schäden ist pflegeintensiv und im Wesentlichen symptomatisch, da es trotz intensiver Forschung bisher noch kein Antidot gibt. Vom Zeitpunkt einer Exposition bis zur Ausbildung klinischer Symptome (Rötung/Blasenbildung) können Stunden bis Tage vergehen. Da dies aber nicht unbedingt durch eine S-Lost-Exposition bedingt sein muss, wurde kürzlich in Zusammenarbeit zwischen dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr (InstPharmToxBw) und der Firma Securetec ein Nachweisverfahren für eine S-Lost-Exposition entwickelt. Hier handelt es sich um einen Schnelltest zum Nachweis von reaktivem S-Lost auf der Haut, der als CE IVD (In-vitro-Diagnostikum gemäß der Richtlinien der Europäischen Union) zertifiziert ist.

Die oben bereits angesprochene Problematik der schlecht heilenden Wunden nach einer S-Lost-Exposition sind Gegenstand verschiedener Forschungsprojekte im InstPharmToxBw, teilweise auch in Zusammenarbeit mit der Ludwig- Maximilians-Universität (LMU) München, der Deutschen Sporthochschule Köln und der Universität Konstanz.

Ein ganz wichtiger Aspekt der Wundheilung ist die Neubildung von Gefäßen. Denn ist eine Wunde gut über das Gefäßsystem versorgt, so kann hierüber alles Notwendige zur Reparatur des Gewebes herantransportiert und Unnötiges abtransportiert werden wie zum Beispiel Immunabwehrzellen, Stammzellen, Fibroblasten oder Nährstoffe. Für eine erfolgreiche Gefäßneubildung ist es notwendig, dass die Vaskulo- und Angiogenese sowie die Migration von Endothelzellen reibungslos ablaufen und Endothelzellen proliferieren, jedoch nicht in einen programmierten Zelltod (Apoptose) gesteuert werden. Um dies alles in einer Einheit analysieren zu können, eignet sich das Modellsystem der embryonalen Stammzellen aus der Maus in besonderem Maße [4, 5].

Die vor längerer Zeit beschriebene verstärkte Radikalenbildung beziehungsweise Belastung unter Einfluss von SLost wurde als ein entscheidender Mechanismus für die pathophysiologischen Auswirkungen von S-Lost gesehen [6]. Auch konnte gezeigt werden, dass Radikale wie NO (Stickstoffmonoxid) eine wichtige Rolle bei der Vaskulo- und Angiogenese spielen [7]. Daher war es naheliegend, den Einfluss von Radikalenfängern auf den Lost-induzierten Schädigungsmechanismus an Gefäßen zu untersuchen.

Dies wird nachfolgend für die beiden Radikalenfänger N-Acetylcystein (NAC) und alpha-Linoleinsäure (ALA) gezeigt.

Bei der Untersuchung der Wundheilung nach einer S-Lost-Schädigung ist ein wichtiger Aspekt die Rolle der basalen Keratinozyten, die die Epidermis bilden und durch Verhornung vor der Außenwelt schützen. Diese Zellen werden bei einer Kontamination mit S-Lost zuerst geschädigt und sie bilden auch am Ende einer Wundheilung den Abschluss des Gewebes und den Schutz vor der Außenwelt. Besonders zu beachten ist hier, dass sich bei einer Kontamination mit S-Lost Keratinozyten und zwar die primären Keratinozyten beziehungsweise epidermalen Stammzellen im Bereich des Stratum basale ablösen. Letzteres äußert sich in der oben erwähnten Blasenbildung.

Von besonderer Bedeutung hierbei ist die Differenzierung der Keratinozyten unter dem Einfluss von S-Lost. Kommt es zu einer vorschnellen Differenzierung der primären Keratinozyten, das heißt, der epidermalen Stammzellen, so können diese nicht in der notwendigen Weise migrieren und proliferieren.

Letzteres wäre jedoch die Voraussetzung für eine funktionierende Wundheilung. Eine Differenzierung der Keratinozyten würde sich dann in einem veränderten Expressionsmuster von Keratin- 1, Involucrin und Loricrin widerspiegeln. Über solche „zellinterne Kommunikationsmechanismen“ würden Veränderungen in der Signaltransduktion induziert werden. In Bezug auf die Differenzierung der Keratinozyten spielen die beiden MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 eine wichtige Rolle, sodass der Einfluss von Veränderungen dieser beiden Signalmoleküle auf die Keratinozytenreifung zu untersuchen wäre.

2. Methoden

Das Gefäßentwicklungsmodell (murine embryonale Stammzellen) wurde in unseren Untersuchungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit Chlorambucil beziehungsweise S-Lost behandelt (Chlorambucil, ein N-Lost Derivat wurde hier als Modellsubstanz für Lost verwendet). Mit Hilfe einer immunhistochemischen Färbung mit einem Antikörper gegen PECAM-1 (CD31) konnten die Gefäßstrukturen angefärbt werden und nachfolgend mit einem Laser-Scanning-Mikroskop (LMS710, Zeiss Jena) erfasst und quantifiziert werden. Die Proliferation und Apoptose der Gefäßendothelzellen wurde mit dem Antikörper gegen PECAM-1 mit Ki-67 als Marker für Proliferation oder in Kombination mit PARP als Apoptose- Marker immunhistochemisch nachgewiesen und anschließend wurden die gefärbten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop (Axioplan, Zeiss Jena) ausgezählt.

Die Migrationsuntersuchungen wurden mit Hilfe eines modifizierten Boyden Chamber Systems durchgeführt. Für detaillierte Angaben zu den Methoden siehe Schmidt et al. 2009 [4] und Steinritz et al. 2010 [5].

Für die Untersuchungen zur Reifung bzw. Differenzierung der primären Keratinozyten wurden die Zellen zunächst mit S-Lost behandelt. Nachfolgend wurde mit Hilfe der PCR (qRTPCR) der mRNA-Gehalt für Keratin-1, Involucrin und Loricrin quantifiziert. Diese Versuchsansätze wurden nachfolgend mit jeweils einem Inhibitor gegen die MAP-Kinase p38 (SB203580) bzw. der ERK1/2 (PD98059) kombiniert. Die Proliferationsuntersuchung erfolgte durch eine Western Blot-Analyse, bei der ein Antikörper gegen PCNA zum Einsatz kam. Mit Hilfe einer immunhistochemischen Färbung konnte in den Keratinozyten die Verteilung von p38 und ERK1/2 untersucht werden, während Phosphorylierungs- und Aktivitätsuntersuchungen mittels Western Blot-Analyse untersucht wurden. Für detaillierte Angaben zu den Methoden siehe Popp et al. 2011 [8].

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1 Wundheilung-Gefäßentwicklung

Zur Analyse der Gefäßentwicklung/- neubildung wurde das Modellsystem der murinen embryonalen Stammzellen verwendet. Die sich differenzierenden Stammzellen bilden unter anderem Gelassen sich alle Prozesse abbilden, die auch bei einer Geweberegeneration oder Wundheilung eine entscheidende Rolle spielen wie Angiogenese, Vaskulogenese und Migration der Endothelzellen.

Der Einfluss von Chlorambucil ist in Abbildung 1dargestellt.

Die Anzahl der Gefäße war unter Chlorambucil (schwarzer Balken) im Vergleich zur Kontrolle Ethanol (weißer Balken) signifikant (p < 0,05) reduziert. Dies zeigte sich in allen Behandlungszeiträumen. Zur stärksten Reduktion der Gefäße kam es bei einer durchgehenden Behandlung von Tag 0 bis Tag 6 (0 bis 6 d). Jedoch trat auch bei den Behandlungszeiträumen von 0 bis 3 Tagen beziehungsweise von 3 bis 6 Tagen eine signifikante Reduktion auf. Das mikroskopische Bild der Gefäßmenge unter dem Einfluss von Chlorambucil spiegelte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Gefäße wider (Abb 2), wobei nur noch vereinzelte Gefäßstrukturen vorlagen, die kaum verzweigt waren. Hierbei kam es auch zu einer verstärkten Schädigung von unreifen im Vergleich zu etablierten Gefäßen. In der Ethanol-Kontrolle zeigten sich reich verzweigte Gefäßstrukturen.

Ebenfalls ließ sich unter Chlorambucil eine stark erhöhte Proliferation in den Endothelzellen der Gefäße beobachten, der jedoch eine erhöhte Apoptose in den Endothelzellen entgegen stand. [2]

Die Migration der Endothelzellen war unter Chlorambucil (schwarzer Balken) im Vergleich zur Kontrolle (weißer Balken) signifikant (p < 0,014) reduziert (Abb 3).

Versucht man nun dem negativen Einfluss von S-Lost entgegen zu wirken, beispielsweise mit den beiden Radikalenfängern NAC und ALA, so zeigte sich nach einer Schädigung durch SLost nur vorübergehend ein positiver Effekt auf die Gefäße. Unter dem Einfluss von 30 µM S-Lost (SM30) und 100 µM S-Lost (SM100) kam es zu einer signifikanten Reduktion der Gefäße. Diese Reduktion der Gefäße konnte durch die Zugabe von NAC (SM30 + NAC; SM100 + NAC) beziehungsweise ALA(SM30 + ALA; SM100 + ALA) vorübergehend aufgehoben werden (3) (Abb 4).

3.2 Wundheilung: Keratinozyten/Fibroblasten

Der Einfluss von S-Lost auf primäre Keratinozyten bestand darin, dass S-Lost die Differenzierung bzw. die Reifung dieser Zellen beschleunigte. Dies spiegelte sich in einer hochregulierten Expression von Keratin-1, Involucrin und Loricrin wider (Abb 5). Unter dem Einfluss von 30 und 100 µM S-Lost erfolgte in den primären Keratinozyten ein signifikanter Anstieg des Gehalts an mRNA für Keratin-1, Involucrin und Loricrin im Vergleich zur Kontrolle am Tag 1 (schwarze Balken) beziehungsweise am Tag 4 der Vergiftung (graue Balken). Hinzu kam, dass S-Lost die Proliferation der primären Keratinozyten unterdrückte.

S-Lost führte auch zur Phosphorylierung, nukleären Translokation und erhöhten Aktivität der beiden MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 (Abb 6). Die Inhibition von p38 bewirkte eine signifikant verringerte Expression von Keratin- 1 und Loricrin, während die Blockierung von ERK1/2 signifikant die Expression der beiden Marker erhöhte.

Dies spricht für gegensätzliche Rollen der beiden MAP-Kinasen im Differenzierungsprozess der primären Keratinozyten [8].

4. Schlussfolgerungen

Die Radikalenfänger NAC und ALA zeigten einen zeitlich begrenzten verbesserten Effekt auf die Gefäße nach einer S-Lost Schädigung. S-Lost stimuliert die Differenzierung von unreifen Keratinozyten über die Aktivität von p38, was ein Grund für die verzögerte Heilung von S-Lost induzierten Wunden darstellen könnte. Die wehrmedizinische Relevanz der Untersuchungen besteht darin, dass neue therapeutische Targets identifiziert wurden, die für die S-Lost vermittelten Pathomechanismen von Bedeutung sein können.

In nachfolgenden Forschungsvorhaben sollen Therapieoptionen gefunden werden, die bei S-Lost-induzierten Langzeitschäden das Potenzial besitzen, als mögliches Antidot Verwendung zu finden.

Literatur:

  1.  Despretz M: Des composes triples du chlore. Ann Chem Phys 1822; 21: 438- 442
  2. Kehe K, Balszuweit F, Emmler J et al.: Sulfur mustard research-strategies for the development of improved medical therapy. Eplasty 2008; 10(8): e32
  3. Koch M, Nehring S: Rüstungsaltlasten in den deutschen Kriegsgewässern – Vorschläge für Sanierungsstrategien im Kontext der Europäischen Wasserrahmenrichtlinien. Rostock. Meeresbiolog. Beitr. 2007; 17: 39-54
  4. Schmidt A, Bölck B, Jedig M et al.: Nitrogene mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology 2009; 263: 32-40
  5. Steinritz D, Bölck B, Schwarz J et al.: Effect of N-Acetyl Cysteine and alpha-Linolenic Acid on Sulfur Mustard Caused Impairment of InVitro Endothelial Tube Formation. Tox Science 2010; 118(2): 521-529
  6. Naghii MR: Sulfur mustard intoxication, oxidative stress and antioxidants. Mil Med. 2002; 167: 573-575
  7. Duda DG, Fukumura D, Jain RK: Role of eNOS in neovascularisation: NO for endothelial progenitor cells. Trends Mol. Med. 2004; 10: 143-145
  8. Popp T, Egea V, Kehe K et al.: Sulfur Mustard induces differentiation in human primary keratinocytes: Opposite roles of p38 and ERK1/2. Tox Letters 2011; 204(1): 43-51

Datum: 22.02.2012

Quelle: Wehrmedizinische Monatsschrift 2011/12

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