Mit NGS dem Täter auf der Spur

Unter Anwendung dieser in ihrer Gesamtheit dem neuen Gebiet „Mikrobielle Forensik“ zugeordneten Methodik wurden die bis dato ältesten Isolate des Erregers des Milzbrands, Bacillus anthracis, untersucht, die aus im Jahr 1917 in einem Spionagefall beschlagnahmtem Material stammten. Dabei ergaben sich schwerwiegende Zweifel an den Schlussfolgerungen, die auf der Grundlage im Jahr 1997 am Originalmaterial durchgeführter molekularbiologischer Untersuchungen gezogen worden waren, und die einen beabsichtigten biologischen Angriff durch einen Agenten scheinbar untermauert hatten, heute jedoch nicht mehr haltbar sind. Eine einfache Laborkontamination ist die weitaus wahrscheinlichere Erklärung und zeigt zudem die Wichtigkeit der Trennung von Forschung und Diagnostik bei forensischen Untersuchungen.

Stichworte: NGS, Vollgenomsequenzierung, Bacillus anthracis, Milzbrand, Sporen

Keywords: NGS, Whole Genome Sequencing, Bacillus anthracis, Anthrax, Spores

Einleitung

Die Idee, mit Hilfe des Einsatzes von Biowaffen den Gegner durch Auslösung von Krankheiten zu schwächen, war immer wieder Gegenstand strategischer und taktischer Überlegungen in früherer Zeit gewesen. Laut Überlieferungen wurden bereits 1346 auf Befehl des Tatarenführers Dschanibek in der genuesischen Hafenstadt Kaffa auf der Krim Pestleichen über die Mauern der belagerten Stadt katapultiert, um die Bevölkerung zur Aufgabe zu bewegen.

Heute könnte im Zusammenhang mit einem verdeckt ausgeführten bioterroristischen Anschlag die kausale Evidenz nicht mehr so offensichtlich sein. Daher ist dem exakten Nachweis des Erregers und der Unterscheidung zwischen einem natürlichen Ausbruch und der absichtlichen Ausbringung eines gefährlichen Agens im Rahmen einer Bioterror-Verdachtslage eine große Bedeutung beizumessen. Das Ergebnis könnte immerhin eine Bandbreite politischer oder auch militärischer Entscheidungen nach sich ziehen und sollte daher äußerst belastbar sein.

An einem Beispiel aus der Zeit des Ersten Weltkriegs sollen hier die heutigen Möglichkeiten und die Bedeutung der molekularen Feintypisierung von Erregern mit modernsten Analysemethoden illustriert werden.

Der „Fall“ Baron von Rosen

Im Jahr 1917 wurde der schwedische Adlige Otto Baron von Rosen an der schwedisch-finnischen Grenze im lappländischen Karasjok von Truppen der Alliierten festgenommen. In seinem Gepäck fand man neben Sprengstoff auch ein Zuckerstück mit einer versteckten kleinen Glasviole. In dieser soll sich Bacillus anthracis, der Erreger des Milzbrands, befunden haben. Rosens Auftrag – so wird berichtet – bestand darin, mit den hochpathogenen Bakterien die Tragtiere der Alliierten zu infizieren und somit den Versorgungsnachschub über Lappland zu sabotieren.

1997: Erste Ermittlungen

Achtzig Jahre später, 1997, wurden die historischen Zucker-stücke neben einem kleinen Zettel mit der Beschriftung “Milzbrand” in einem Polizeimuseum in Trondheim in einer Schublade wiedergefunden (Abbildung 1). Nur Instituten mit einer speziellen Infrastruktur war es im Jahr 1997 möglich, mit dem hochpathogenen Milzbrand-Erreger zu arbeiten. So übersandte man damals die Fundstücke ins englische Porton Down, wo sich auch heute noch ein Hochsicherheitslabor der britischen Regierung befindet.

Nach vorheriger Dekontamination des Arbeitsplatzes gelang es dort unter großen Mühen vier Kolonien des vermuteten Erregers aus der extrahierten Flüssigkeit der Glasviole auf festen Nährmedien anzuzüchten. Die damals zur Verfügung stehenden Mittel erlaubten eine molekulare Identifizierung der angezüchteten Bakterien als B. anthracis, indem man mittels PCR nicht nur Erreger-spezifische chromosomale Genomsequenzen, sondern zusätzlich auch seine zwei Virulenzplasmide nachwies ¹.

2009: Wiederaufnahme der Untersuchungen

Im Jahr 2009 konnte das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (IMB) aus Porton Down die DNA der drei zu diesem Zeitpunkt noch anzüchtbaren Isolate aus den mit den Glasviolen von Otto Baron von Rosen in Zusammenhang stehenden B.-anthracis--Kolonien des Jahres 1997 für weitergehende Analysen erhalten. Die bereits damals zur Verfügung stehende Typisiermethode „MLVA“[1], zeigte jedoch ein unerwartetes Ergebnis, da sie nicht in der Lage war, die Stämme aus dem Jahr 1917 von dem Typstamm “Ames Ancestor” aus dem Jahr 1981 oder dem Stamm “A2012”, der im Jahr 2001 bei den Briefanschlägen in den Vereinigten Staaten von Amerika verwendet wurde, zu unterscheiden.

2017: NGS bringt Wahrheit ans Licht

Im Jahr 2017 wurde die DNA der Proben dann mittels Next Generation Sequencing (NGS) untersucht. Dabei konnten zunächst die Identifizierungs-Ergebnisse von 1997 bestätigt werden: Es handelte sich bei den auf Nähragar angezüchteten Kolonien tatsächlich um B. anthracis. Alle drei damals entstandenen Isolate (=Kolonien) wiesen neben dem B.-anthracis-spezifischen Chromosom auch die beiden typischen Virulenzplasmide des Anthrax-Erregers auf.

Zwei von den drei gewonnenen Isolaten zeigten zudem vollständig identische Genomsequenzen und wiesen nur ein Nukleotid Unterschied zum Isolat aus der dritten Kolonie auf. Da bereits die 2009 durchgeführte MLVA-Typisierung eine sehr hohe genetische Verwandtschaft der Isolate zu dem Ames-Stamm, der auch im Rahmen der Milzbrandbrief-Anschläge in den USA im Jahr 2001 verwendet worden war, ergeben hatte, wurden alle in Datenbanken verfügbaren Ames-Vollgenomsequenzen zum -Vergleich herangezogen und mit der DNA der Isolate aus den Zucker-stückchen von 1917 verglichen. Es zeigte sich, dass sich die drei Stämme um nur exakt ein Nukleotid von den Ur--Abimpfungen aus dem Jahr 1981 („Texas 1981“) unterscheiden (Abbildung 2). In einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Paul Keim an der Northern Arizona State University konnten diese Ergebnisse auch unabhängig von uns reproduziert werden.

NGS klärt Zusammenhänge auf

B. anthracis ist ein genetisch klonaler Organismus, der sich im Laufe seiner Vermehrung nur wenig bzw. langsam durch zufällige Mutationen genetisch verändert. Anhand dieser Mutationen lassen sich mit den heutigen Methoden Stämme aus unterschiedlichen Regionen oder unterschiedlichen Isolationsjahren vonein-ander klar unterscheiden. Zwei Stämme aus der gleichen Region in Texas unterscheiden sich zum Beispiel nach 4 Jahren um bis zu 23 Nukleotide (Abb. 3 Stamm A0394 vs. A1117).

Bei den hier beobachteten wenigen Unterschieden von 1-2 Nukleotiden bestehen jedoch mehr als starke Zweifel, dass es einen direkten epidemiologischen Zusammenhang zwischen Baron von Rosen, dem mutmaßlichen Spion im 1. Weltkrieg, mit dem die Glasphiolen-Stämme assoziiert sind, und einem toten Rind aus Texas aus dem Jahr 1981, von dem der Ames-Stamm herrührt, geben kann. Hätte der Stamm tatsächlich einem deutschen Biowaffenprogramm zu Zeiten des Ersten Weltkriegs entstammt, hätte man eher einen genetischen Fingerabdruck erwartet, der denjenigen von B.-anthracis-Stämmen aus dem zentraleuropäischen Raum ähnlich ist. Tatsächlich existiert aber aus Zentraleuropa bisher kein einziges Isolat, das eine solche Nähe zum Ames-Stamm von 1981 aufweist, wie dies bei den mutmaßlichen Isolaten aus den Glasphiolen der Fall war.

Hinweise erbrachten in diesem Zusammenhang Nachforschungen, die zu den Briefanschlägen aus dem Jahr 2001 angestellt worden waren [2]. Daraus ließ sich ermitteln, dass bereits im Jahr 1982 eine Abimpfung des Ames-Stammes nach Porton Down verbracht und dort insbesondere im Zeitraum um 1998 von Dr. Manchee und Kollegen im Rahmen von Plasmidversuchen stark genutzt worden war (Abbildung 2). Weiterhin ist im Bericht zu den Isolaten aus den bei von Rosen 1917 gesicherten Zucker-Asservaten erkennbar, dass die originären Anzuchtversuche sich als äußerst schwierig erwiesen hatten. Erst die Inokulation einer Agarplatte mit einer bereits vorher beimpften Flüssigkultur hatte zum Wachstum der besagten vier Kolonien im Randbereich der Platte geführt.

Ein weiteres Indiz ergab die Kontaktaufnahme mit den damals leitenden Wissenschaftlern aus Porton Down. Nach deren Information hatte die dortige Einrichtung zu diesem Zeitpunkt noch nicht über eine infrastrukturelle Trennung zwischen Forschungs- und Diagnostikarbeiten verfügt. Somit kann es als höchst wahrscheinlich gelten, dass es sich bei den vier damals angezüchteten Kolonien um eine einfache Laborkontamination mit dem Ames-Stamm und nicht um einen inzwischen 100 Jahre alten eigenständigen Stamm handelt. Zum Zeitpunkt der Isolierung waren Typisierungsmethoden wie die MLVA noch nicht entwickelt, und die Wissenschaftler handelten damals nach bestem Wissen und Gewissen. Ohne die heutigen methodischen Fähigkeiten zur Vollgenomsequenzierung und ohne die inzwischen sehr umfassenden Sequenz-Datenbanken von B.-anthracis-Stämmen hätte dieses „Aufklärungsergebnis“ nicht erzielt werden können.

Fazit

Dieses „Fallbeispiel“ zeigt einmal mehr die Möglichkeiten, die durch die neuen Sequenziertechnologien eröffnet werden. Diese sind in der Lage, selbst einzelne Stämme von anderen der gleichen Spezies sicher abzugrenzen. Wäre noch Flüssigkeit aus den damaligen Glasphiolen vorhanden, könnte heute sicher nachgewiesen werden, ob sich darin jemals der Erreger des Milzbrandes befunden hatte. Schuld oder Unschuld des Barons von Rosen hätte damit bewiesen werden können.

Das Beispiel zeigt sehr prägnant die Weiterentwicklungen im Forschungsbereich „Genomik“ innerhalb der letzten Jahre. Es wird aber auch deutlich, wie komplex es ist, mit der jeweiligen State-of-the-Art-Technologie verlässliche und nachhaltige Ergebnisse sowie Einschätzungen zu produzieren. Die Aussagekraft und Diskriminierungsfähigkeit der Methodik ist insbesondere in solchen Fällen wichtig, in denen ein biologischer Angriff so darzulegen ist, dass die ermittelten Beweise Grundlage für eine Anklage vor dem Internationalen Strafgerichtshof sein können oder in denen sie als Basis einer politischen oder sogar militärischen Reaktion verwendet werden sollen. Bei hinreichender Probenqualität stellen die Vollgenomsequenzierung und die darauf basierenden Analysen bereits heute die aussagekräftigsten Methoden dar und sind damit essentieller Bestandteil bei Rückverfolgungsermittlungen im Rahmen der mikrobiellen Forensik. Nicht minder wichtig ist jedoch auch die Implementierung geeigneter Beweissicherungsmaßnahmen zur Wahrung der Integrität der Probe, d. h. zum Beispiel zur Vermeidung von Probenverwechslungen oder Probenkontaminationen.

Literatur

1. Redmond C, Pearce MJ, Manchee RJ, Berdal BP: Deadly Relic of the Great War, Nature 1998; 393: 747-748.
2. Read TD: Comparative Genome Sequencing for Discovery of Novel Polymorphisms in Bacillus anthracis, Science 2002; 296: 2028-2033. 
3. Antwerpen MH, Sahl JW, Birdsel D, Pearson T, Pearce MJ, Redmond C, Meyer H, Keim PS: Unexpected Relations of Historical Anthrax Strain, mBio 2017; 8(2): e00440-17.

Verfasser
Oberregierungsrat Dr. Markus H. Antwerpen
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
Neuherbergstraße 11
80937 München
E-Mail: markusantwerpen@bundeswehr.org 

1 MLVA, Multi-Locus-Variable-Number-of Tandem-Repeat (VNTR)--Analyse, eine molekulare Typisiermethode, technisch vergleichbar mit einem Vaterschaftstest.

Datum: 14.06.2019

Quelle:

Markus H. Antwerpen