MOBILER CHOLINESTERASE-SCHNELLTEST ZUR FELDDIAGNOSTIK EINER ORGANOPHOSPHAT-EXPOSITION IM VOLLBLUT

Labormedizinische Verfahren, wie die Bestimmung der Erythrozyten-Acetylcholinesterase (AChE)-Aktivität im Vollblut, sind derzeit für die mobile Diagnostik nicht verfügbar.
 

Methoden:

In einem von der Bundeswehr beauftragten Entwicklungsvorhaben wurde ein mobiles In-vitro-Diagnostikum (IVD) für die Bestimmung der AChE- und Butyrylcholinesterase (BChE)-Aktivität im Vollblut (ChE-Schnelltest IVD) entwickelt und CE-zertifiziert.

Ergebnisse:

Das handliche ChE-Schnelltest IVD erlaubt die genaue und reproduzierbare Bestimmung der AChE- und BChE-Aktivität im Vollblut innerhalb von 4 Minuten bei einer Umgebungstemperatur von 10-50°C. Der einfache Testablauf erfordert wenige Arbeitsschritte und erfolgt menügesteuert. Die Interpretation der Messergebnisse wird durch integrierte Informationen und Handlungsanweisungen unterstützt und erlaubt die sichere Testdurchführung nach kurzer Einweisung.

Schlussfolgerungen:

Mit dem nun verfügbaren CE-zertifizierten ChE-Schnelltest IVD steht ein labormedizinisches Verfahren zur Verfügung, das die schnelle und genaue Bestimmung der AChE- (und BChE)-Aktivität im Vollblut sowohl in stationären Sanitätseinrichtungen wie auch durch dislozierte Kräfte im In- und Ausland erlaubt. Dadurch können die diagnostischen Fähigkeiten des Sanitätsdienstes der Bundeswehr bei Verdacht auf Exposition durch Organophosphate, im Besonderen auch im Einsatz, erheblich erweitert werden.

Mobile cholinesterase assay for the field diagnosis of organophosphate exposure in whole blood

Summary

Background:

Presently, the evaluation of clinical signs and symptoms is the only possibility for rapid diagnosis of poisoning by organophosphorus compounds (OP), i. e. nerve agents and pesticides. Up to now laboratory procedures, e. g. determination of erythrocyte acetylcholinesterase (AChE) activity in whole blood, are not available for on site diagnosis.

Methods:

A Bundeswehr funded research project resulted in the development and CE certification of a mobile in vitro test system for the analysis of AChE and butyrylcholinesterase (BChE) activity in whole blood (ChE-Schnelltest IVD).

Results:

The handy test system enables the precise and reproducible determination of AChE and BChE activity within 4 minutes at ambient temperatures of 10 to 50°C. The simple test procedure requires few menu-driven operations and the interpretation of test results is supported by additional information and instruction thus enabling the test execution after short training.

Conclusions:

The now available CE certified test system provides a laboratory tool for the rapid and precise determination of AChE and BChE activities in whole blood in medical installations and mobile forces and may broaden the diagnostic capabilities of the Bundeswehr medical service, especially during mission, in case of suspected exposure to organophosphorus compounds.

1. Einleitung

Die irreversible Hemmung des lebenswichtigen Enzyms Acetylcholinesterase (AChE) ist die wichtigste toxikologische Wirkung phosphororganischer Verbindungen, beziehungsweise Organophosphate (OP), die als Nervenkampfstoffe und Pestizide in Frage kommen [1]. Eine Inhibition der AChE durch OP resultiert, in Abhängigkeit von der resorbierten Dosis und dem Aufnahmeweg, in einer Anhäufung von Acetylcholin im synaptischen Spalt cholinerg innervierter Gewebe. Dies verursacht vielfältige Störungen von Organfunktionen, die letztlich zum Tod durch zentrales und peripheres Atemversagen führen können [2].

Die Beurteilung der klinischen Symptomatik ist derzeit die einzige Möglichkeit, eine manifeste Vergiftung durch OP zu diagnostizieren und adäquate therapeutische Maßnahmen einzuleiten [3]. Allerdings erfordert die Bestätigung der klinischen Diagnose labormedizinische Verfahren, vor allem in Fällen einer OP-Exposition mit schwach ausgeprägter und unklarer Symptomatik. Neben komplexen, zeit- und kostenintensiven, apparativen analytischen Methoden zum Nachweis von OP im biologischen Material mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie (LCMS- MS) besteht prinzipiell die Möglichkeit die erythrozytäre AChE-Aktivität im Vollblut für die initiale und schnelle Bestätigung einer Exposition mit Cholinesterase-Hemmstoffen zu bestimmen [4]. Durch zahlreiche experimentelle und klinische Studien konnte inzwischen gezeigt werden, dass eine hohe funktionelle Übereinstimmung zwischen erythrozytärer und synaptischer AChE besteht und somit die AChE der Erythrozyten als Surrogat-Parameter für die synaptische (muskuläre) AChE geeignet ist [5-7].

Im Rahmen der klinischen Diagnostik von Vergiftungen durch OP wird weiterhin nahezu ausschließlich die Aktivität der Butyrylcholinesterase (BChE) im Plasma bestimmt, obwohl Daten zu erheblichen strukturellen und funktionellen Unterschieden zwischen AChE und BChE vorliegen [8]. Die fehlende Verfügbarkeit von Fertig-Kits für in der Klinischen Chemie verwendete Analysensysteme verhindert die routinemäßige Bestimmung der AChE-Aktivität im Vollblut. Gegenwärtig wird die Analyse dieses Parameters nur in wenigen Speziallaboratorien, wie zum Beispiel am Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr (InstPharmToxBw), durchgeführt.

Vor geraumer Zeit wurde ein mobiles Cholinesterase-Testsystem (Testmate ChE Cholinesterase Test System, EQM Research, Cincinatti, USA) vom InstPharmToxBw auf seine Eignung als feldverwendungsfähiges System für die Bestimmung der AChE-Aktivität im Blut untersucht. Nach einer entsprechenden Optimierung wurde es für den Einsatz im Sanitätsdienst der Bundeswehr als geeignet bewertet [9]. Allerdings konnte das System nicht in den Sanitätsdienst der Bundeswehr eingeführt werden, da die Herstellerfirma nicht bereit war, die erforderliche CE-Zertifizierung durchzuführen.

Angesichts dieser Situation wurde durch die Bundeswehr ein Auftrag an die Fa. Securetec Detektions-Systeme AG, Brunnthal, vergeben, um in enger Zusammenarbeit mit InstPharmToxBw ein Schnelltestsystem als In-vitro-Diagnostikum zur schnellen Vor-Ort-Erkennung einer Exposition mit Cholinesterase- Hemmstoffen aus humanem Vollblut zu entwickeln. Während der Laufzeit des Entwicklungsvorhabens vom 18.03.2009 bis 30.08.2010 konnte auftragsgemäß ein geeignetes In-vitro- Diagnostikum, das die vom Auftraggeber vorgegebenen Spezifikationen erfüllt, entwickelt und das Projekt Ende August 2010 mit der CE-Zertifizierung erfolgreich abgeschlossen werden.

2. Methoden

2. 1 ChE-Schnelltest IVD (ChE check mobile)

Das ChE-Schnelltest IVD wurde als Komplettsystem für die Bestimmung der AChE (und BChE)-Aktivität im Vollblut konzipiert. Wesentliche Anforderungen waren: Verwendbarkeit im Einsatz, Handlichkeit, Benutzerfreundlichkeit, Bedienungskomfort, Messgenauigkeit und -reproduzierbarkeit. Das In-vitro-Diagnostikum (IVD) setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen (Abb 1):

• Reagenzien-Kits für die Bestimmung der AChE- und BChE-Aktivität bestehend aus 100 Probenflaschen mit 2 ml Puffer und weißem Transportdeckel, 100 Reagenziendeckel (AChE rot; BChE gelb), 100 EDTABlutentnahmekapillaren (10 µl) und Filterpapier (100 Blatt). Im Reagenziendeckel sind das Chromogen 5,5’-Dithio-bis-2-Ni tro ben - zoe säure (DTNB), das Substrat Acetylthiocholin und der selektive BChE-Inhibitor AS1397 fixiert (für die Bestimmung der BChE-Aktivität enthält der Reagenziendeckel DTNB und das Substrat Butyrylthiocholin).
• Analyseneinheit für die photometrische Bestimmung des Hämoglobingehalts und der AChE (BChE) Aktivität in der Blutverdünnung bei 470 nm; großes Touch Pad, zur Dateneingabe, Menüsteuerung, Ergebnisanzeige und Anzeige von Handlungsanweisungen; Energieversorgung über Batterie, Akku oder (Bord-)Netz; interne Messwertspeicherung mit Auslesbarkeit über eine USB-Schnittstelle.

Für die Durchführung der Bestimmungen wird weiteres, nicht im IVD enthaltenes, Material benötigt: Schutzhandschuhe, Abfallbehälter, Desinfektionsmittel, Stichlanzetten und Tupfer.

2.2 Messvorgang

Die Messung der AChE (BChE)-Aktivität erfolgt in folgenden, menügeführten Schritten (Abb 2):

• Einsetzen des Probenfläschchens, Messung der Grundabsorption („Blank“).
• Blutzugabe (10 µl Blutkapillare), Schütteln des Probenfläschchens und Messung der Hämoglobinkonzentration der Blutverdünnung.
• Aufschrauben des farbigen Reagenziendeckels und Mischen der Blutverdünnung.
• Messung der AChE- beziehungsweise BChE-Aktivität.
• Ausgabe der auf den Hämoglobingehalt der Blutverdünnung und 37°C normierten AChE (BChE)-Aktivität in U/g Hb.
• Anzeige von Fehlermeldungen, Zusatzinformationen und Handlungsanweisungen bei leicht oder stark erniedrigter AChE (BChE)-Aktivität.
• Die Gesamtanalysendauer beträgt circa 4 Minuten.

2.3 Testspezifikation

• Messtemperatur: 10-50°C, Messwerte werden auf 37°C normiert.
• Messbereich: AChE (BChE) 3-200 % der mittleren Normwerte, Hämoglobin 5- 20 g/dl.
• Genauigkeit: Korrelation der Messwerte mit der Referenzmethode R²>0.9. Als Referenzmethode wurde die im InstPharmToxBw etablierte spektrophotometrische Methode zur Bestimmung der AChE- und BChE-Aktivität im Vollblut verwendet [9, 10].
• Reproduzierbarkeit: Intra-Day- und Inter- Day-Variabilität <5 %, Inter-Operator-Variabilität <7 %.

3. Ergebnisse und Diskussion

Ziel des von der Bundeswehr vergebenen Vorhabens war die Entwicklung und CE-Zertifizierung eines mobilen Invitro- Diagnostikums (IVD) zur schnellen Bestimmung der AChE-Aktivität im Vollblut durch den Sanitätsdienst der Bundeswehr im In- und Ausland, im Besonderen für Einsatzbedingungen. Mit diesem IVD sollte die Fähigkeit bereit gestellt werden, bei einer vermuteten Vergiftung durch OP die klinische Diagnostik zu bestätigen. Vor allem galt es, im Fall einer schwach ausgeprägten und unklaren Symptomatik den behandelnden Arzt bei der Diagnosestellung zu unterstützen und eine rechtzeitige und zielgerichtete Antidottherapie zu ermöglichen.

Wesentliche Voraussetzung für die Verwendbarkeit des ChE-Schnelltest IVD ist die Funktionsfähigkeit in unterschiedlichen Klimazonen und die Normierung der Messergebnisse auf 37°C. Abb 3 zeigt exemplarisch die Bestimmung nativer und OP-gehemmter AChE im Vollblut bei unterschiedlichen Temperaturen mit dem ChE-Schnelltest IVD und die Eignung der verwendeten Algorithmen bei der Kompensation der unterschiedlichen Temperaturen. Damit besteht die Möglichkeit, die AChE (und BChE)-Aktivität im Vollblut im Bereich von 10 bis 50°C genau zu bestimmen und etwaige Temperaturunterschiede bei Mehrfachbestimmungen zu kompensieren.

Die Verwendung des ChE-Schnelltest IVD für die labormedizinische Diagnostik einer Exposition durch Cholinesterase- Hemmstoffe erfordert die genaue Messung der AChE (und BChE)-Aktivität über einen großen Aktivitätsbereich. Die Bestimmung der AChE (und BChE)-Aktivitäten in Blutproben mit unterschiedlicher Enzymaktivität ergab eine lineare Beziehung über einen großen Aktivitätsbereich, wie beispielhaft für die AChE in Abb 4 gezeigt wird. Eine weitere Anforderung an die Eignung des ChE-Schnelltest IVD bestand in der Vergleichbarkeit der Messergebnisse mit einer Referenzmethode, hier die im InstPharmToxBw eingeführte modifizierte Ellman-Methode [4, 10, 11].

Letztere ist gemäß DIN EN ISO 15189 akkreditiert. Die Bestimmung von Blutproben unterschiedlicher AChE- und BChE-Aktivitäten mit beiden Methoden ergab eine für biologische Proben exzellente Korrelation ( Tab 1). Auch bei der Untersuchung weiterer Kriterien (Intra- Day-, Inter-Day- und Inter-Operator- Variabilität) konnten die Anforderungen der Spezifikation erfüllt werden ( Tab 2).

Bei weiterführenden Untersuchungen konnte zudem eine gute Übereinstimmung zwischen dem ChE-Schnelltest IVD und der Referenzmethode bei der Bestimmung der AChE-Aktivität in den Blutproben Pestizid-vergifteter Patienten gezeigt werden ( Abb 5).

Das handliche ChE-Schnelltest IVD zeichnet sich zudem durch Benutzerfreundlichkeit und Bedienungskomfort aus. Für die menügesteuerte Testdurchführung sind nur wenige einfache Arbeitsschritte erforderlich und die Bewertung der Messergebnisse wird durch verständliche Interpretationshilfen und Handlungsanweisungen unterstützt. Damit ist die Verwendung des ChE-Schnelltest IVD auch für den Ungeübten nach kurzer Einweisung möglich.

4. Schlussfolgerungen

Mit dem nun verfügbaren CE zertifizierten ChE-Schnelltest IVD steht ein labormedizinisches Verfahren zur Verfügung, das die schnelle und genaue Bestimmung der AChE- und BChE-Aktivitäten im Vollblut sowohl in stationären Sanitätseinrichtungen als auch durch dislozierte Kräfte im In- und Ausland, vor allem auch im Einsatz erlaubt. Dadurch können die diagnostischen Fähigkeiten des Sanitätsdienstes der Bundeswehr bei Verdacht auf eine Exposition durch OP erheblich erweitert werden.

Literatur:

1. Holmstedt B: Pharmacology of organophosphorus cholinesterase inhibitors. Pharmacol Rev 1959; 11: 567-688.
2. Ballantyne B, Marrs TC: Overview of the biological and clinical aspects of organophosphates and carbamates. In: Ballantyne B and Marrs TC [eds.]: Clinical and experimental toxicology of organophosphates and carbamates. Oxford: Butterworth & Heinemann 1992, 3-14.
3. Baker DJ: Organophosphate poisoning: aspects of emergency and critical care management. Crit Care&Shock 1999; 2: 72-78.
4. Worek F, Koller M, Thiermann H, et al.: Diagnostic aspects of organophosphate poisoning. Toxicology 2005; 214: 182-189.
5. Eckert S, Eyer P, Herkert N, et al.: Comparison of the oxime-induced reactivation of erythrocyte and muscle acetylcholinesterase following inhibition by sarin and paraoxon, using a perfusion model for the real-time determination of membrane-bound acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 2008; 75: 698-703.
6. Thiermann H, Zilker T, Eyer F, et al.: Monitoring of neuromuscular transmission in organophosphate pesticide-poisoned patients. Toxicol Lett 2009; 191: 297-304.
7. Thiermann H, Worek F, Eyer F, et al.: Obidoxime in acute organophosphate poisoning: 2 – PK/PD relationships. Clin Toxicol 2009; 47: 807-813.
8. Aurbek N, Thiermann H, Eyer F, et al.: Suitability of human butyrylcholinesterase as therapeutic marker and pseudo catalytic scavenger in organophosphate poisoning: A kinetic analysis. Toxicology 2009; 259: 133-139.
9. Worek F, Pfeiffer B, Eyer P, et al.: Optimierung labormedizinischer Verfahren zur Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität im Blut für die Diagnostik und Therapiesteuerung von Nervenkampfstoffvergiftungen. Teil 1: Feldverwendungsfähige Verfahren. Wehrmed Mschr 2005; 49: 298-302.
10. Worek F, Mast U, Kiderlen D, et al.: Improved determination of acetylcholinesterase activity in human whole blood. Clin Chim Acta 1999; 288: 73-90.
11. Worek F, Pfeiffer B, Eyer P, et al.: Optimierung labormedizinischer Verfahren zur Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität im Blut für die Diagnostik und Therapiesteuerung von Nervenkampfstoffvergiftungen. Teil 2: Automatisierte Verfahren. Wehrmed Mschr 2005; 49: 302-305.

Datum: 25.06.2011

Quelle: Wehrmedizinische Monatsschrift 2011/4