UMBAUVORGÄNGE DES AKTINZELLSKELETTS ALS EINFLUSSFAKTOR AUF DIE WUNDHEILUNG IM RAHMEN VON KOMBINATIONSSCHÄDEN

Ein positiver Effekt von eingewanderten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) auf die Wundheilung wurde in zahlreichen Publikationen beschrieben, doch die Mechanismen der Migration von MSCs in das Wundgebiet sowie der Einfluss ionisierender Strahlung auf den hierfür notwendigen Aktinumbau sind noch weitgehend unerforscht. Diese Arbeit stellt das Konzept und erste Ergebnisse eines diesbezüglichen Forschungsvorhabens vor.
Methoden: Zum Einsatz kamen bislang Methoden der Zellkultur (Kultivierung humaner Knochenmarks-MSCs) sowie der Immunfluoreszenzmikroskopie. Im weiteren Verlauf sind Methoden der Proteinbiochemie sowie die Durchführung von funktionellen Untersuchungen (Migrations- und Invasionsassays) in Verbindung mit Transfektionsexperimenten geplant.
Ergebnisse: Erste Ergebnisse zeigen die Ausbildung lamellipodienartiger Zellfortsätze sowie eine kräftige Expression der zentralen Regulatorproteine Cortactin und Abelson interactor 1in kultivierten MSCs.
Schlussfolgerungen: Das Vorhandensein von Zellstrukturen und Regulatorproteinen, welche für die zelluläre Migration von essenzieller Bedeutung sind, in kultivierten MSCs  wurde in den ersten Untersuchungen bestätigt. In der Folge werden die Effekte ionisierender Strahlung auf die Ausbildung dieser Strukturen, die Expression und subzelluläre Lokalisation von Regulatorproteinen und auf die zelluläre Migrationsfähigkeit untersucht. Schließlich soll ein möglicher therapeutischer Nutzen der pharmakologischen Beeinflussung oder genetischen Modifikation von MSC zur Behandlung von Kombinationsschäden untersucht werden.
Schlagworte: Kombinationsschaden, Wundheilung, mesenchymale Stammzellen, zelluläre Migration

Summary

Background: The term „combined injury“ specifies conventional wounds exposed to ionizing radiation which are characterized by delayed wound healing and impeded wound management. A positive effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) on wound healing has been previously described, but mechanisms of cell migration into the wound area as well as the effects of ionizing radiation on actin dynamics, which are pivotal for cellular movement, remain widely unexplored. This article presents concept and preliminary results of a corresponding research project.
Methods: Up to now, cell culture (cultivation of human bone marrow-derived MSCs) and immunofluorescence microscopy methods were used. Protein biochemistry analyses and functional (cell migration and invasion) assays in combination with transfection experiments are planned.
Results: First results show the formation of lamellipodia like cellular protrusions and strong expression of key regulators of actin dynamics (Cortactin and Abelson interactor 1) in cultivated MSCs.
Conclusions: Formation of cellular structures and expression of regulatory proteins that are crucial for cellular migration could be shown in cultivated MSCs. In ongoing research the effect of ionizing radiation on the formation of cellular protrusions, on expression and subcellular localization of regulatory molecules and on the migratory ability of MSCs will be analyzed. Finally, a potential therapeutic use for pharmacologic treatment or genetic modification of MSCs in the management of combined injury will be evaluated.
Keywords: Combined injury, wound healing, mesenchymal stem cells, cell migration

Einführung

Unter einem Kombinationsschaden versteht man eine konventionelle Verletzung oder Verwundung, die mit einer gleichzeitigen Exposition gegenüber ionisierender Strahlung einhergeht oder die durch Radionuklide kontaminiert ist (engl. radiation combined injury, RCI). Ein solches Szenario ist zum Beispiel im Rahmen eines Kraftwerksunfalles, einer militärischen Auseinandersetzung oder eines Terroranschlages vorstellbar; in der Folge der Atombombendetonationen über Hiroshima und Nagasaki waren bis zu 65 % der Verletzungen dem RCI-Spektrum zuzuordnen [1, 2]. Neben der erschwerten Erstbehandlung kontaminierter Wunden durch den notwendigen Eigenschutz des Sanitätspersonals stellen diese Verletzungen den Behandler auch im mittel- und langfristigen Verlauf vor große Herausforderungen; als solche sind bakterielle Infektionen, ein mögliches Schockgeschehen durch unkontrollierte Zytokinfreisetzung oder eine verzögerte Wundheilung zu nennen [1]. Dies macht einen multidisziplinären Ansatz unter Einbeziehung chirurgischer, internistischer und intensivmedizinischer Fähigkeiten notwendig; darüber hinaus sollte ein Hinzuziehen radiobiologischer Expertise erfolgen [3]. Es konnte in Vorarbeiten gezeigt werden, dass eine Exposition gegenüber ionisierender Strahlung den physiologischen Ablauf der Wundheilung stört; so zeigte eine 2013 erschienene Studie, dass die Migration von Keratinozyten, welche eine Voraussetzung für den Wundverschluss ist, unter ionisierender Strahlung deutlich verlangsamt wird [4]. Weiterhin wurde dargestellt, dass die verzögerte Wundheilung mit einer lokale Depletion an Entzündungszellen und einer vermehrten Freisetzung der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) einhergeht; letzteres scheint unter dem Einfluss einer erhöhten lokalen Zytokinausschüttung zu stehen [5].

In den letzten Jahren wurde die Bedeutung mesenchymaler Stammzellen (MSCs) für die Wundheilung immer besser verstanden. MSCs können beispielsweise aus dem Knochenmark (BM-MSCs), aus Fettgewebe oder aus Nabelschnurblut isoliert werden; insbesondere das Knochenmark stellt hier ein großes, sich stets erneuerndes Reservoir dar [6]. Es wurde gezeigt, dass BM-MSCs in Hautwunden einwandern können und durch die Freisetzung von Botenstoffen wie vascular endothelial growth factor alpha (VEGF-alpha), insulin-like growth factor 1 (IGF-1), keratinocyte growth factor, Angiopoietin-1 und Erythropoietin die Einwanderung von Makrophagen und die Differenzierung von endothelialen Vorläuferzellen fördern [7]. Hierdurch werden der Wundschluss beschleunigt und die Vaskularisierung verbessert, was Narbenbildung vorbeugt und die Pathogenabwehr im Wundbereich unterstützt.

Die Einwanderung von MSCs in den Bereich der (Kombinations-)Verletzung stellt einen noch relativ wenig erforschten Prozess dar. Es konnte gezeigt werden, dass sich MSCs, welche einen fibroblastenähnlichen Phänotyp zeigen, bereits innerhalb der ersten 24 Stunden nach einem Gewebeschaden in der Wundumgebung anreichern [8]; für diesen als „homing“ bezeichneten Vorgang scheint die Bindung von im Bereich der Verletzung freigesetztem stromal cell derived factor (SDF-1) an den CXCR4-Rezeptor auf den MSCs von zentraler Bedeutung zu sein [9, 10]. Dieser Rezeptor setzt intrazelluläre Phosphorylierungskaskaden in Gang, welche einen migrationsfördernden Effekt auf die Zelle vermitteln [11, 10]. Eine schematische Darstellung des MSC-„homing“ zeigt Abbildung 1. Für die aktive Beweglichkeit von Zellen im Rahmen solcher Migrationsvorgänge spielen gerichtete Umbauvorgänge des Aktinzellskeletts eine entscheidende Rolle; reguliert wird dieser Umbau von Aktinnukleationsfaktoren (ANFs) wie dem actin-related protein 2/3 (Arp2/3), welcher in einem ANF-Komplex mit weiteren Interaktionspartnern die Ausbildung von lamellipodienartigen Zellfortsätzen unterstützt (eine detaillierte Übersicht über Mechanismen des Aktinumbaus gibt Literaturhinweis [12]). Zentrale Regulatorproteine, welche in diesem Komplex nachweisbar sind und die Umgestaltung des Aktinnetwerks fördern, sind Abelson interactor 1 (Abi1), Cortactin sowie Proteine der Wiskott-Aldrich-Syndrom-Familie (WASP/WAVE)[13, 14].

In dem hier vorgestellten Projekt geht es um den Einfluss von ionisierender Strahlung auf die Migrationsfähigkeit von BM-MSCs; es soll hierbei insbesondere folgenden Fragen nachgegangen werden:

• Wie wirkt sich ionisierende Strahlung auf die Expression und subzelluläre Lokalisation von Regulatorproteinen des Aktinumbaus aus?
• Welche Änderungen im Phosphorylierungsmuster und welche Protein-Protein-Interaktionen sind nach einer Exposition nachweisbar?
• Ist die Strahlenantwort der MSCs durch pharmakologische Beeinflussung von Proteinphosphorylierungen und/oder genetische Modifikationen steuerbar?

Insbesondere die letzte Fragestellung birgt die Chance, einen pharmakologischen Angriffspunkt zu identifizieren, um die BM-MSC-Antwort auf Kombinationsschäden zu verbessern und somit den Heilungsprozess dieser problematischen Verwundungen zu unterstützen.

Methoden

Mesenchymale Stammzellen (MSCs)
Humane MSCs wurden aus Knochenmarkaspirat freiwilliger Spender gewonnen und freundlicherweise durch das Institut für klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik der Universität Ulm zur Verfügung gestellt.

Immunfluoreszenzfärbung und Mikroskopie
Die subzelluläre Verteilung von Cortactin (1:500, Sigma, St. Louis, USA) und Abelson interactor 1 (Abi1, 1:250, MBL, Woburn, USA) in kultivierten humanen MSCs wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Darstellung des Aktinzytoskeletts bzw. der Zellkerne erfolgte durch Färbung mit Texas Red- bzw. Fluoresceinisothiocyanat-(FITC-) gekoppeltem Phalloidin (Molecular Probes/Life technologies, Darmstadt, DE) und Eindecken mit wässrigem, 4’,6-Diamidino-2-phenylindol-(DAPI)-haltigem Eindeckmedium (Vector Laboratories, Burlingame, USA) gemäß unserem bereits publizierten Protokoll [14, 15].

Erste Ergebnisse

Die bislang vorliegenden ersten Ergebnisse der Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen die Ausbildung verschiedenartiger Zellausläufer durch kultivierte mesenchymale Stammzellen; so sind beispielsweise schmale, fingerartige Filopodien (Pfeilmarkierung) und breitbasige Lamellipodien (Pfeilspitzen) zu sehen (Abb. 2a). Die Färbung mit einem fluoreszenzgekoppelten Antikörper gegen Cortactin zeigt eine kräftige zytoplasmatische Expression des Proteins in den kultivierten Zellen (grünes Färbesignal in Abb. 2b und c). Die Färbung mit einem fluoreszenzgekoppelten Antikörper gegen Abelson interactor 1 (Abi1) zeigt ebenfalls eine deutliche Positivität in lamellipodienartigen Zellausläufern (Abb. 2d, Pfeilspitze).
Diese ersten Ergebnisse zeigen somit, dass zentrale Regulatorproteine des Aktinumbaus (Cortactin und Abi1) in kultivierten mesenchymalen Stammzellen exprimiert werden und Abi1 in lamellopodienartige Zellfortsätze lokalisiert.

Diskussion und Ausblick

Aus dem Knochenmark gewonnene mesenchymale Stammzellen (MSCs) stellen eine vielversprechende Therapieoption bei einer mit radioaktiver Kontamination einhergehenden Verwundung (sog. Kombinationsschaden) dar [16]. Die Mechanismen des „homing“ der Stammzellen in das Verwundungsareal sind daher seit längerem Gegenstand intensiver Forschung, doch der Einfluss ionisierender Strahlung auf die Migrationsfähigkeit von MSCs wurde bislang noch nicht untersucht. Ziel des Projektes ist es daher, den Effekt ionisierender Strahlung auf Umbauvorgänge des Aktinzellskeletts im Rahmen der Migration von MSCs zu untersuchen.
Die ersten Ergebnisse zeigen deutlich die Ausbildung von spezialisierten Zellausläufern, sogenannten Lamellipodien, in kultivierten humanen MSCs. Das Vorhandensein von Lamellipodien ist eine Voraussetzung für die Migrationsbewegung, bei der sich die Zelle in die Richtung des ausgestülpten Zellfortsatzes bewegt [12]. Lamellipodien entstehen durch die Verzweigung von Aktinfilamenten, welche durch die Aktivität von Aktinnukleationsfaktoren (ANFs) rasch ein stabiles Netzwerk erzeugen; die Ausbildung dieses Zellskeletts stellt somit einen kritischen Punkt bei der zellulären Migration dar [12]. Regulatorproteine, die in einem ANF-Multiproteinkomplex vorkommen, steuern die Umgestaltung des Zellskeletts lokal und in Reaktion auf Umgebungsreize [17, 18]. Zentrale Proteine, die in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle spielen, sind zum Beispiel Cortactin und Abi1. Während Cortactin als Strukturprotein Aktinfilamente und Aktinnukleationsfaktoren in der Polymerisierungszone bündelt, rekrutiert Abi1 über seine src-homology domain die Abelson-Tyrosinkinase, welche den ANF-Komplex über Phosphorylierung von WAVE2 aktiviert [18, 19].
Die hier vorgestellten ersten Ergebnisse zeigen, dass beide Proteine in humanen MSCs exprimiert werden und dass Abi1 in lamellipodialen Zellausläufern nachzuweisen ist. Dies weist auf eine Rolle von Abi1 bei der Ausbildung solcher Fortsätze hin und wirft die Frage auf, ob eine Exposition gegenüber ionisierender Strahlung Auswirkungen auf die subzelluläre Lokalisation von Abi1 und/oder anderen ANFs hat. In einem derartigen Modell, das schematisch in Abb. 3 dargestellt ist, würde die Strahlenexposition – entweder über eine Verringerung der MAP-Kinaseaktivität oder durch eine verminderte Expression oder aberrante Lokalisation von Regulatorproteinen wie Cortactin oder Abi1 – den Aktinumbau und damit die Ausbildung von lamellipodienartigen Zellausläufern verhindern, was zu einer erschwerten Rekrutierung von MSCs in den Bereich der Wunde führte, mit den dadurch entstehenden negativen Folgen für die Wundheilung.
Diesen Fragen wird in weiteren Untersuchungen nachgegangen und hierbei der Focus insbesondere auf die Proteinexpression von Abi1, den Phosphorylierungsstatus von Proteinen des ANF-Komplexes und der Migrationsfähigkeit der MSCs gelegt. Hierzu ist am Institut für Radiobiologie der Bundeswehr ein in vitro-Migrationsassay etabliert, der es erlaubt, die zelluläre Migrationsfähigkeit nach Bestrahlung oder nach gezieltem Knockdown von einzelnen Proteinen mit spezifischen inhibitorischen RNAs zu untersuchen. Zudem besteht die Möglichkeit, durch Transfektionsexperimente einen möglichen therapeutischen Effekt von rekombinantem Abi1 oder anderer ANF auf die Migrationsfähigkeit von hMSCs zu untersuchen. Schließlich sollen die Ergebnisse dazu beitragen, die Pathophysiologie von Kombinationsschäden besser zu verstehen und mögliche therapeutische Ansätze für diese Art von Verwundungen zu evaluieren.

Literatur

1. Ran XZ, Shi CM, Zheng HE, Su YP, Cheng TM: Experimental research on the management of combined radiation-burn injury in China. Radiat Res 2011; 175 (3):382-389.
2. DiCarlo AL, Ramakrishnan N, Hatchett RJ: Radiation combined injury: overview of NIAID research. Health Phys 2010; 98 (6):863-867.
3. Williams G, O’Malley M: Surgical considerations in the management of combined radiation blast injury casualties caused by a radiological dirty bomb. Injury 2010; 41 (9):943 - 947.
4. Isoir M, Roque T, Squiban C et al.: Protective effect of geranylgeranylacetone against radiation-induced delayed effects on human keratinocytes. Radiat Res 2013; 179 (2):232-242.
5. Kiang JG, Jiao W, Cary LH et al.: Wound trauma increases radiation-induced mortality by activation of iNOS pathway and elevation of cytokine concentrations and bacterial infection. Radiat Res 2010;  173 (3):319-332.
6. Mehanni SS, Ibrahim NF, Hassan AR, Rashed LA: New approach of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human amniotic epithelial cells applications in accelerating wound healing of irradiated albino rats. Int J Stem Cells 2013;  6 (1):45-54.
7. Chen L, Tredget EE, Wu PY, Wu Y: Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing. PLoS One 2008;  3 (4):0001886.
8. Seppanen E, Roy E, Ellis R et al.: Distant mesenchymal progenitors contribute to skin wound healing and produce collagen: evidence from a murine fetal microchimerism model. PLoS One 2013;  8 (5)
9. Hannoush EJ, Sifri ZC, Elhassan IO et al.: Impact of enhanced mobilization of bone marrow derived cells to site of injury. J Trauma 2011;  71 (2):283-289.
10. Marquez-Curtis LA, Janowska-Wieczorek A Enhancing the Migration Ability of Mesenchymal Stromal Cells by Targeting the SDF-1/CXCR4 Axis. Biomed Res Int. 2013;2013:561098. Epub 2013 Dec 5.,

Interessenkonflikt:
Die Verfasser erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Bildquellennachweis: Abb. 1-3: Oberstabsarzt Dr. Dr. Steinestel, Institut für Radiobiologie der Bundeswehr

Datum: 09.07.2014

Quelle: Wehrmedizinische Monatsschrift 2014/5