PERSPEKTIVEN MODERNER PCR-DIAGNOSTIK IN DER TROPENMEDIZIN

„Klassische“ direkte Nachweismethoden wie die Lichtmikroskopie oder antigen-basierte Schnellteste sind für den Nachweis einiger Erreger einerseits wenig aussagekräftig, anderseits ist die komplette Infrastruktur eines mikrobiologischen Feldlabors nicht an jeden Ort zu verlegen.Gerade die Luftverlegefähigkeit der Sanitätseinrichtung unter engen Zeitvorgaben ist ein wesentlicher und limitierender Faktor. Auch das zeitkritische Management von Ausbrüchen stellt eine besondere infektiologische Herausforderung dar. Moderne molekulare Verfahren, insbesondere die „Realtime“-PCR könnten hier in naher Zukunft Abhilfe schaffen.

Einleitung

Bei dem derzeitigen Einsatzspektrum der Bundeswehr ist mit weiteren Einsätzen in tropischen Klimaregionen zu rechnen, die den Sanitätsdienst vor besondere Herausforderungen im Umgang und im Management der dort vorherrschenden Infektionskrankheiten stellen. Begünstigt durch enges Zusammenleben in Feldlagern unter schwierigen klimatischen Bedingungen kann die Ausbreitung von Infektionskrankheiten sehr rasch die Einsatzfähigkeit eines Verbandes gefährden. Besondere Widrigkeiten wie z.B. die Einwirkung sintflutartiger Regenfälle im Kongoeinsatz 2006 (Abb. 1) werden sehr rasch zu unkalkulierbaren hygienischen Risiken mit anschaubaren Folgen. Kurz nach Einsetzen der Regenfälle wurde dabei exemplarisch ein steiler Anstieg von Durchfallerkrankungen ab der 39. Kalenderwoche beobachtet, der zunächst weitere dramatische Auswirkungen befürchten lies (Abb. 2). Über die Ätiologie des Geschehens wurde nichts bekannt, da keinerlei Möglichkeit zur Identifikation der Erreger vor Ort bestand. Auch eine Versendung der Proben ans Leitlabor in Koblenz konnte wegen eingeschränkter Transportkapazitäten nicht zeitgerecht organisiert werden. In besonders schweren Einzelfällen musste daher eine ungezielte „kalkulierte“ Antibiotikatherapie durchgeführt werden. Unter Berücksichtigung aller in den Tropen möglicherweise vorkommenden Erreger greifen in diesen Situationen die in Deutschland gültigen Empfehlungen und Algorithmen nur selten.
Durchfälle sind neben Atemwegsinfekten und unklarem Fieber die häufigsten medizinischen Probleme in militärischen Kontingenten im tropischen Ausland. Auslöser von Diarrhoen, die zu schwerer Allgemeinsymptomatik auch bei immunkompetenten Soldaten führen können, sind neben bakteriellen Erreger (wie z.B. Salmonellen, Shigellen, Campylobacter, EIEC u.a.) und Viren (Noro-, Rota-, u.a. Viren) in tropischen Ländern vor allem die intestinalen Parasiten Entamoeba histolytica, Cryptosporidium spp. oder Giardia lamblia (duodenalis). Bei Kontamination von Wasser und Trinkwasser können durch diese Parasiten allesamt auch Ausbrüche verursachen. Im Falle der Amöben kann es sogar zu einem akut lebensbedrohlichen Krankheitsbild (Amöbenruhr) bzw. im späteren Verlauf zu einem Amöbenleberabszess mit deutlich höherer Inzidenz bei Männern kommen.
In diesen besonderen Einsatzsituationen ist die Verfügbarkeit einer schnellen, sowohl hochempfindlichen (sensitiven) als auch spezifischen Diagnostik von Infektionserregern sehr hilfreich, um zeitgerecht gezielte Therapien einleiten und eine effektive Ausbruchsbekämpfung durchführen zu können.

Problemfelder tropenmedizinischer Mikrobiologie

Die zeit- und patientennahe Abklärung tropenmedizinisch relevanter Infektionen und Krankheitsbilder wie z.B. Fieber oder Durchfall unter Feld- und Einsatzbedingungen ist mit besonderen Problemen behaftet: einerseits erfordert das Vorkommen bei uns seltener Erkrankungen und ihrer Erreger (z.B. Plasmodien, Amöben) eine besondere Vorbereitung und Inübunghaltung des Laborpersonals, andererseits stellt das Vorhalten infektionsdiagnostischer Kapazitäten einschließlich kultureller Verfahren mit biochemischer Identifizierung von Bakterien einen hohen logistischen Aufwand dar, der im Einsatz nicht allerorts zu realisieren ist. Daher kann zeitgleich nur an wenigen Auslandsstandorten, meist ab der Behandlungsebene 3, ein mikrobiologisches Feldlabor aufgebaut und betrieben werden, das ein breites Untersuchungsspektrum und Laborarbeiten mit klassischen mikrobiologischen Methoden bis zur Sicherheitsstufe 2 zulässt. Derzeit unterhält der Sanitätsdienst lediglich an den Standorten Prizren (KFOR) sowie in Masar-E-Sharif (ISAF) ein mikrobiologisches Labor.
Während das Ergebnis kultureller Verfahren erst nach mehreren Tagen vorliegt, wäre bei Ausbrüchen die schnelle Identifikation von Indexpatienten zur Vermeidung von Sekundärinfektionen noch am gleichen Tag wünschenswert. Insbesondere bei Verdacht auf Erkrankungen hervorgerufen durch gefährliche und hochgefährliche Erreger können die Proben derzeit jedoch erst nach einem (zeit-) aufwendigen Versand in ein geeignetes Referenzlabor im Heimatland untersucht werden. Einsatztaktische Vorgaben wie die schnelle Luftverlegefähigkeit der Einsatzkräfte und der Sanitätseinrichtung bzw. unwegsames Gelände schließen die Verwendung einer containergestützten Laborinfrastruktur im Einsatz häufig aus. Andererseits ist die Integration kultureller Verfahren in zeltgestützten Einrichtungen unter Berücksichtigung von Arbeitsschutz und biologischer Sicherheit nach derzeitigem Stand nicht realisierbar. Direkte Nachweisverfahren wie die Lichtmikroskopie oder immunologische Schnellteste, die sich in ein klinisch-chemisches Feldlabor integrieren lassen (s. Abb. 3), sind in ihrer Empfindlichkeit und Aussagekraft jedoch eingeschränkt. Lediglich bei der Malaria, der wichtigsten tropenmedizinischen Differentialdiagnose, gilt die Lichtmikroskopie weiterhin als diagnostischer Goldstandard. Daneben kann sie ebenfalls sehr gut zur orientierenden Liquordiagnostik eingesetzt werden. Allerdings ist für eine weitergehende Infektionsdiagnostik insbesondere bakterieller oder viraler Infektionen ein umfassenderes Methodenspektrum unabdingbar.
Ein weiteres Problemfeld stellt die Situation im Einsatzland bzw. der Krisenregion dar: nur selten stehen im Einsatzland selbst oder auch bei Beanspruchung von „Host Nation Support“ in der Region Laboreinrichtungen zur Verfügung, die nach unseren mikrobiologischen Standards verlässliche Befunde liefern können. Gerade in Krisensituationen wie bei den Missionen 2005 in Banda Aceh bzw. 2006 in der Demokratischen Republik Congo sind zivile Einrichtungen zerstört oder fehlen gänzlich.

Neue Lösungsansätze durch Verwendung molekularer Techniken

Bereits an zahlreichen zivilen und militärischen Einrichtungen in Deutschland hat dieMolekularbiologie bei bestimmten Fragestellungen Einzug in das mikrobiologische Labor gehalten. Zukünftig könnte der gezielte Einsatz von Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken (NAT) bzw. der Polymerasekettenreaktion (PCR) eine schnelle und befriedigende Antwort auf klinisch-infektiologische Fragen auch im Einsatzszenario liefern. Während die konventionelle PCR mit anschließender Gelelektrophorese zunächst noch eine Reihe von Arbeitsschritten erforderte, die allesamt das Risiko einer Kontamination erhöhten, konnten sich innerhalb des letzten Jahrzehnts moderne geschlossene Systeme mit Echtzeit- („Realtime“)-Detektion durchsetzen. Mit einem überschaubaren Aufwand an technischer Ausstattung (Abb. 4) werden dabei spezifische Genabschnitte verschiedener Erreger vermehrt („amplifiziert“) und im gleichen Arbeitsschritt nachgewiesen. Diese Systeme erhöhen die diagnostische Sicherheit durch Verwendung von farbstoffmarkierten Sonden entscheidend und erlauben zudem einen simultanen Erregernachweis in einem Reaktionsansatz (Abb. 5). Damit können einerseits die Kosten eines Ansatzes auf wenige Euro reduziert und andererseits der Arbeitsaufwand im Rahmen gehalten werden. Ohne die Notwendigkeit einer kulturellen Anreicherung liegt ein zuverlässiges Ergebnis unter Verwendung von inaktiviertem Probenmaterial bereits innerhalb von 2 bis 3 Stunden vor.
Kurz nach Aufstellung des Fachbereichs Tropenmedizin am Bernhard-Nocht-Institut (BNI) in Hamburg wurde im Rahmen eines Sonderforschungsprojekt in zivil-militärischer Zusammenarbeit begonnen, verschiedene diagnostische PCR-Assays auf einer robusten Geräteplattform zu etablieren und auf ihre Anwendbarkeit in den Tropen zu testen. Während infektionsepidemiologischer Feldstudien unter Leitung von Prof. Dr. May konnten bislang Proben von 2500 Kindern in Agogo/ Ghana gewonnen und vor Ort in der vom Bernhard-Nocht-Institut betriebenen Forschungseinrichtung dem Kumasi Center for Collaborative Research (KCCR) untersucht werden (Abb. 6 und 7). Dabei wurde einerseits auf ein bereits am BNI vorhandenes Verfahren zur simultanen Detektion von Entamoeba histolytica, Cryptosporidium parvum und Giardia lamblia sowie publizierte Verfahren zum Nachweis von Noro- und Rotaviren zurückgegriffen, andererseits konnte ein neuer Assay zum Parallel-Nachweis bakterieller Durchfallerreger (Salmonellen, Shigellen/EIEC, Campylobacter jejuni und Yersinien) entwickelt und evaluiert werden.
Während der bisherigen Studienaufenthalte in Ghana wurden bereits wertvolle Erfahrungen in Bezug auf Transport der technischen Ausstattung sowie der Reagenzien gesammelt. Der Betrieb des PCR-Cyclers im Hinblick auf die örtlichen, technischen und klimatischen Bedingungen erwies sich als problemlos und zuverlässig. Auch die DNAPräparation erfolgte zuverlässig durch das dort lokal angestellte ghanaische Laborpersonal.
Die bisher ausgewerteten Ergebnisse sind in Tab. 1 dargestellt. Ein Vergleich mit der ebenfalls vor Ort durchgeführten Lichtmikroskopie zeigt, dass die PCR alle lichtmikroskopisch positiven Parasiten-Befunde bestätigen konnte und darüber hinaus eine deutlichhöhere Empfindlichkeit besitzt. Lediglich in 3 Proben (0,1%) konnte Entamoeba histolytica mittels PCR bestätigt werden. Bei 21/24 der in der Lichtmikroskopie nachgewiesen Entamöben zeigte die PCR dagegen ein positives Ergebnis für die apathogene Form E. dispar. Somit konnte die PCR in den weitaus häufigeren Fällen ein falsch-positives Ergebnis aufklären und damit eine unnötige Belastung der Patienten durch eine Antibiotikatherapie (hier: Metronidazol) vermeiden helfen.
Im Gegensatz zu häufig frustranen Versuchen, verwertbare mikrobiologische Ergebnisse unter „afrikanischen“ Bedingungen zu erlangen, lieferte die PCR im Rahmen dieser Untersuchung wertvolle neue infektionsepidemiologische Daten zu Bedeutung enteropathogener Bakterien im tropischen Afrika. Am BNI zusätzlich durchgeführte Kontrolluntersuchungen zur Qualitätssicherung ergaben keine Abweichungen von den in Ghana erhobenen Befunden.
Neben den Evaluierungen in Ghana konnte der Fachbereich Tropenmedizin die neu etablierten Techniken bereits im Rahmen zweier Einsatzszenarien anwenden. Im Februar 2009 kam es auf der Fregatte „Rheinland-Pfalz“ während der Verlegungsfahrt nach Djibouti zu einer Häufung von Durchfallerkrankungen bei 40 Besatzungsangehörigen. Bei der Unterstützung der Ausbruchsuntersuchung durch den zuständigen Hygieniker konnte mit Hilfe der am Fachbereich verfügbaren PCRVerfahren innerhalb weniger Stunden ab Eintreffen der Proben relevante virale, bakterielle und parasitäre Durchfallerreger ausgeschlossen werden. Einsatztaktisch wurde hier noch auf eine Verlegung der Laborgruppe in den Einsatz verzichtet, da eine Toxin-Vergiftung angenommen wurde und der „Ausbruch“ keine weitere Dynamik zeigte.
Die sich ab April 2009 ausbreitende Influenza A/H1N1-Pandemie („Schweinegrippe“) machte kurz darauf eine schnelle Reaktion der Laborgruppe Tropenmedizin notwendig. In Zusammenarbeit mit der Abteilung Virologie des BNI konnte innerhalb weniger Tage ein neuer PCR-Assay, der durch ein Expertennetzwerk zur Verfügung gestellt wurde, auf das Gerätesystem des Fachbereichs etabliert werden. In der Folge war der Fachbereich an der Diagnostik des ersten klinischen Falles am Universitätsklinikum Hamburg, sowie an der Aufklärung verschiedener lokaler Ausbrüche innerhalb der Bundeswehr beteiligt. Schließlich erfolgte auf Anweisung des EinsFüKdo eine Verlegung der mobilen PCR-Ausstattung mit Personal in den Einsatz ISAF an den Standort MeS zur kurzfristigen Schließung einer diagnostischen Fähigkeitslücke vor Ort (Abb. 8). Bereits vor Auftreten erster Verdachtsfälle stand dem Einsatzverband damit ein zuverlässiges Instrument zur Erkennung und Eindämmung dieser neuen Influenza-Variante zur Verfügung.

Diskussion und Ausblick

Moderne Entwicklungen auf dem Gebiet der molekularen Infektionsdiagnostik stellen interessante Optionen für den Sanitätsdienst der Zukunft dar. Gerade Einsatzoptionen unter tropischen Bedingungen mit der Prämisse schneller Verlege- und Einsatzfähigkeit machen dagegen das Vorhalten „klassischer“ mikrobiologischer Verfahren unmöglich.
Mit der Etablierung und Erprobung moderner Multiplex/Realtime-PCR-Verfahren zum Nachweis von Durchfallerregern (enteropathogene Parasiten, Bakterien und Viren) auf einer mobilen feld- bzw. tropentauglichen Geräteplattform steht dem Fachbereich Tropenmedizin nunmehr ein breites diagnostisches Spektrum zur Abklärung von Diarrhoen im Einsatz zur Verfügung. Damit kann derzeit eine umfassende Durchfall-Diagnostik ohne aufwendige kulturelle Verfahren z.B. in einem Rettungszentrum bei einer Ausbruchsuntersuchung angeboten werden. Weitere Assays zum Nachweis tropenmedizinisch relevanter Erreger bzw. zur Abklärung fieberhafter Erkrankungen sind derzeit in Erprobung.
Erste Erfahrungen mit der PCR-Diagnostik im Einsatz konnten während der Influenza-Pandemie gesammelt werden. Gerade die Möglichkeit zur schnellen Etablierung neuer Verfahren auf einer bewährten und benutzerfreundlichen Geräteplattform hat sich bei diesem Ereignis als besonders wertvoll erwiesen.
Eine Aufnahme und weitergehende Anwendung von PCR-Verfahren in das diagnostische Leistungsspektrum der Feldlabore insbesondere auf der Leistungsebene 2 steht derzeit zur Diskussion. Derzeit wird die Einführung eines vollautomatisierten PCR-Systems mit integrierter Probenaufbereitung zunächst für das MRSA-Screening und ggf. auch für eine weitere infektiologische Diagnostik (Influenza, Tuberkulose u.a.) vorrangig verfolgt. Hierzu liegen jedoch noch keine unabhängigen Validierungsdaten und Erprobungserfahrungen unter tropischen Bedingungen vor. Die Bedienerfreundlichkeit für das Einsatzpersonal sowie das Vermeiden von Kontaminationen unter Einsatzbedingungen sind dabei wichtige Kriterien bei der Auswahl geeigneter technischer Lösungen. Allerdings bleibt es ab abzuwarten, ob „geschlossene“ und kommerziell angebotene Systeme ausreichend Antworten auf Probleme der Tropenmedizin geben können. Es ist nicht zu erwarten, das profitorientierte Unternehmen die bei uns selten vorkommenden Tropenkrankheiten in den Focus ihrer Entwicklungsarbeit stellen. Daher sind zukünftig weitere Bemühungen und eigene Entwicklungsarbeiten in den Instituten des Sanitätsdienstes notwendig.

Datum: 26.10.2010

Quelle: Wehrmedizin und Wehrpharmazie 2010/3