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NACHWEIS DER VERGIFTUNGEN MIT C-KAMPFSTOFFEN: EINSATZ DER VORORT- UND VERIFIKATIONSANALYTIK

Seit ihrer erstmaligen Verwendung während des ersten Weltkrieges vor nunmehr 100 Jahren gehen von chemischen Kampfstoffen (CKS) latente Vergiftungsgefahren für das Militär und die Zivilbevölkerung aus.

Trotz der Verbote durch die Haager Deklaration von 1899, das Genfer Protokoll von 1925 und das Inkrafttreten des Chemiewaffenübereinkommens (CWÜ) von 1997, zeigen gegenwärtige politische Ereignisse die erschreckende Aktualität der Bedrohung. PhotoAbb. 1: Funktionsprinzip des Lost-Detektors (lateral flow assay)

Durch das CWÜ werden Entwicklung, Herstellung, Lagerung und Einsatz von CKS verboten, die Vernichtung noch vorhandener Bestände in militärischen Arsenalen geregelt und die Deklaration aller Chemikalien, die Missbrauchspotential besitzen, von den Unterzeichnerstaaten eingefordert. Diese Bestimmungen werden durch die Organisation für das Verbot Chemischer Waffen (OVCW) überwacht, die für ihre „extensiven Bestrebungen zur Vernichtung chemischer Waffen“ im Jahr 2013 mit dem Friedensnobelpreis ausgezeichnet wurde. Dennoch zeigen die grausamen Ereignisse des Iran/Irak Krieges von 1988, des Terroranschlages in der Tokioter U-Bahn von 1995 sowie des Syrienkonfliktes im Jahr 2013, dass der Einsatz tödlicher Gifte, wie beispielsweise des Nervenkampfstoffes (NKS) Sarin, im Zuge staatlicher und asymmetrischer Konflikte fatale Realität ist.
Daher begegnet die Bundeswehr im Rahmen internationaler Einsätze in Krisengebieten dieser Gefahr unter anderem mit modernen Möglichkeiten des medizinischen C-Schutzes (Med C-Schutz). Neben fundierter Ausbildung der Soldaten, geeigneten Schutzausrüstungen, der Bereitstellung einer mobilen Eingreiftruppe (Task Force Med C-Schutz) und Empfehlung effizienter Therapien gehören dazu besonders die Entwicklung und Bereitstellung diagnostischer und bioanalytischer Verfahren. Diese erlauben, das Gift und seine Inkorporation nachzuweisen. Eine schnelle Vorort-Analytik kann die Notwendigkeit therapeutischer Intervention dokumentieren und Behandlungserfolge im Zuge eines Therapiemonitorings im Feldlazarett aufzeigen. Die nachträgliche Post-Expositionsanalyse in den Speziallaboratorien des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr (InstPharmToxBw) hingegen dient primär dem justiziablen Nachweis der Kampfstoffaufnahme (Verifikationsanalytik), um mit hoch-selektiven Verfahren die Exposition zu beweisen. Die technischen Herausforderungen, Methoden und Prinzipien der Vorort- und Verifikationsanalytik werden nachfolgend vorgestellt.

Vorort-Analytik
Das Auftreten von Vergiftungssymptomen in Krisen- und Einsatzgebieten, die auf die Wirkung von CKS hinweisen, erfordert durch die zuständigen Ärzte eine umgehende Diagnose, um Therapieentscheidungen treffen zu können. Dabei kann die Task Force Med C-Schutz diagnostisch und beratend unterstützen. Idealerweise fußt die Diagnose auch auf analytisch erhobenen Parametern. Die Vorort-Analytik im Med C-Schutz muss am Einsatzort jedoch auf komplexe analytische Instrumente verzichten, da diese an die Infrastruktur eines ortsfesten Labores gebunden sind. Dennoch besteht das Erfordernis, toxikologisch relevante Daten zur Diagnostik zu erheben. Daher wurde durch intensive Entwicklungsarbeiten des InstPharmToxBw in Zusammenarbeit mit der Firma Securetec Detektions-Systeme AG die Einführung feldtauglicher diagnostischer Systeme realisiert, die unmittelbar am Einsatzort erlauben, die Exposition und Vergiftung mit Haut- und Nervenkampfstoffen zu analysieren.

Lost-Detektor                                                                                                                                                                               
Der Lost-Detektor (Sulfur Mustard Detector) ist ein handliches Einweg-Testsystem zur in-vitro Diagnostik und liefert mittels Hautabstrich innerhalb von 10 Minuten ein qualitatives Ergebnis über die Präsenz von Schwefellost. Es werden weder zusätzliche Gerätschaften noch Strom benötigt. Das Nachweisverfahren beruht auf dem Funktionsprinzip der lateralen Streifendurchflusschromatographie (lateral flow assay) in Kombination mit einer immunologischen Antigen-Antikörper-Reaktion ähnlich der eines Immunoassays. Vergleichbare technische Konzepte werden als Schnelltest in der Drogen-Analytik, den diagnostischen Point-of-care Tests oder den weithin bekannten Schwangerschaftstests (Detektion des Hormons hCG) genutzt.
Die Untersuchung mit dem Lost-Detektor wird dazu wie folgt durchgeführt:

PhotoAbb. 2: Untersuchung der Cholinesterase-Aktivitäten mittels (A) ChE check mobile und (B) ChE status monitor.

Freies Lost auf der Haut wird mit einem kleinen angefeuchteten Wischer, der sich auf der einen Seite des Detektors befindet, aufgenommen und reagiert dort mit Guanin-reichen Oligonukleotiden zu Lost-Addukten (Abb. 1A). Diese werden automatisch auf die Startzone des Teststreifens übertragen, in der sich durch Gold rot gefärbte anti-Lost-Addukt-Antikörper (AK) im Überschuss befinden (Abb. 1A). Die freien AK binden die Lost-Addukte zu AK-Addukt-Komplexen (Abb. 1B). Durch Zerdrücken einer im Detektor integrierten Ampulle wird anschließend Puffer freigesetzt, der über Kapillarkräfte zum anderen Ende des Teststreifens gezogen wird und dabei die AK-Addukt-Komplexe mitführt (Abb. 1B). An einer über ein Sichtfenster einsehbaren Stelle des Teststreifens sind Zweitantikörper immobilisiert (Testlinie), die nun ihrerseits den AK-Addukt-Komplex über die Oligonukleotid-Komponente binden und festhalten können (Abb. 1C). Diese Bindung zeigt sich als rote Linie auf dem Teststreifen und gilt als Nachweis des Lostes. Zu Kontrollzwecken befindet sich in einer nachfolgenden Reaktionszone auf dem Teststreifen eine weitere Linie (Kontrolllinie), auf der andere Zweitantikörper immobilisiert sind, welche den AK selbst festhalten (Abb. 1C). Eine rot gefärbte Kontrolllinie zeigt somit den erfolgreich verlaufenen Test an. Nach Passieren der Reaktionszonen tritt der Puffer in einen saugfähigen Flies ein, der als Abfallreservoir dient.
Dieses immunologische Testsystem ist jedoch im juristischen und strengen wissenschaftlichem Sinne nur ein hinweisgebendes und kein beweisendes Verfahren. Zum Beweis einer Exposition wird daher zusätzlich eine bestätigende Verifikationsanalytik gefordert. Nichtsdestotrotz, ermöglicht der Lost-Detektor eine wertvolle frühe Analytik, die die schnelle Warnung und zeitnahe medizinische Beobachtung betroffener Soldaten zulässt.

ChE check mobile                                                                                                                                                                     
Das ChE check mobile (Abb. 2A) erlaubt über die Analyse eines einzigen Tropfen Blutes nach Fingerkuppenpunktion in Minutenschnelle eine Beurteilung der Vergiftungssituation durch Inhibitoren der Cholinesterasen. Mit Hilfe des kompakten batterie- oder netzstrom-betriebenen Gerätes können in einfachen Arbeitsschritten, die auf einem integrierten Bildschirm erläutert werden, die Enzymaktivitäten der Acetylcholinesterase (AChE) aus Erythrozyten sowie die der Plasmacholinesterase (Butyrylcholinesterase, BChE) quantifiziert werden. PhotoAbb. 3: Verifikationsanalytik am InstPharmToxBw: Nachweis der Nervenkampfstoffe in Plasma (B) und ihrer Hydrolyseprodukte in Urin (C) (Daten erhoben durch Frau ORRin Dr. Koller).

 

Nervenkampfstoffe reagieren wie auch phosphororganische Pestizide unter anderem mit Cholinesterasen und bewirken deren häufig irreversible Inhibition. Die Blockade der AChE, welche in den synaptischen Spalten des zentralen und peripheren Nervensystems für die Acetylcholin-mediierte Signaltransduktion von entscheidender regulierender Bedeutung ist, ist ursächlich für die akute toxikologische Wirkung der Gifte. Da die AChE nicht nur in den Synapsen, sondern auch auf der Oberfläche von Erythrozyten exprimiert ist, ermöglicht die Bestimmung der Ery-AChE Aktivität im Vollblut ex vivo als Surrogatparameter die Kennzeichnung des Ausmaßes der Vergiftung. Zusätzlich findet sich in der Zirkulation in freier Form die BChE, die ebenso wie AChE durch NKS inhibiert wird. Somit kann eine erniedrigte BChE-Aktivität ebenfalls einen deutlichen Hinweis auf Gift-Inkorporation liefern. Basierend auf dem Prinzip des colorimetrischen Ellman-Assays ist das Gerät in der Lage, photometrisch ein farbiges Reaktionsprodukt zu bestimmen, welches in Abhängigkeit von der Cholinesterase-Aktivität gebildet wird. Das Photometer erfasst zeitabhängig die Veränderungen der UV-Absorption, berechnet nach Abschluss der Messung automatisch die Enzymaktivitäten und bewertet diese im Vergleich zu Normwerten.
Die Entwicklung und Einführung oben genannter Analyse- und Diagnosesysteme basiert auf modernen wissenschaftlichen Erkenntnissen, die im Rahmen der anwendungsorientierten Forschung am InstPharmToxBw gewonnen wurden. So verdeutlicht zudem die Markteinführung des ChE status monitor (Abb. 2B) –eines Diagnosegerätes, das zur Therapiekontrolle bei NKS Vergiftungen im Feldlazarett genutzt werden kann- im Jahr 2013 den Nutzen der wehrmedizinischen Forschung für den Soldaten im Einsatz.
Biologische Proben, die auch durch die Task Force Med C-Schutz genommen werden können, werden der Verifikationsanalytik bei InstPharmToxBw zugeführt. Diese Untersuchungen bringen einige essentielle Herausforderungen mit sich.

Verifikationsanalytik
Zwei wesentliche Charakteristika der CKS stellen entscheidende Limitationen für den bioanalytischen Nachweis ihrer Inkorporation dar: 1. die hohe chemische Reaktivität in Verbindung mit geringer Stabilität in vivo und 2. die geringen aufgenommenen Mengen.
Die hohe Reaktionsfähigkeit mit körpereigenen Zielmolekülen wie Proteinen und DNA zu Protein- und DNA-Addukten sowie die Hydrolyse (Reaktion mit Wasser) sorgen für eine schnelle Abnahme der Konzentration des originären Giftes in der Zirkulation. Abhängig vom CKS kann schon nach einigen Minuten bis wenigen Stunden nach Giftaufnahme der Nachweis als intakte Giftmoleküle nicht mehr möglich sein. Im Gegenzug jedoch steigen die Konzentrationen ihrer jeweiligen Abbau- und Biotransformationsprodukte (Fremdstoffmetabolite) in Blut und Urin. Doch schon innerhalb von Stunden bis wenigen Tagen werden die einfachen Hydrolyseprodukte über den Urin ausgeschieden. Protein- und DNA-Addukte hingegen haben deutlich längere Lebenszeiten und können daher noch wenige Wochen nach Giftexposition im Blut oder Gewebe nachgewiesen werden.
Um somit den unveränderten CKS oder seine einfachen Hydrolyseprodukte im Blut oder Urin von potentiell vergifteten Personen nachweisen zu können, sollte die Probennahme idealerweise zeitnah innerhalb weniger Stunden nach Exposition erfolgen. Kann die Probengewinnung erst nach Tagen getätigt werden, können lediglich noch Protein- und möglicherweise DNA-Addukte erfasst werden. In jedem Falle sollten die Proben durch Zusatz bestimmter Chemikalien stabilisiert werden, um sie dann bei -80°C gefroren an InstPharmToxBw zu versenden.
Bedingt durch die geringe Konzentration der Gifte und ihrer Reaktions- und Abbauprodukte erfordert der bioanalytische Nachweis eine moderne Spezialanalytik, die sich auf hoch-selektive und sensitive Instrumente stützt. Dabei handelt es sich vorwiegend um kombinierte Techniken von gas- oder flüssigchromatographischer Trennung mit massenspektrometrischer Detektion, denen eine ausgefeilte, zum Teil komplexe Probenaufbereitung vorangeht. Die Verfahren erlauben auch geringe toxikologisch relevante Konzentrationen der Gifte in einer komplexen Matrix wie Blut oder Urin sicher nachzuweisen. Nachfolgend werden zum besseren Verständnis die erforderlichen Teilschritte skizziert.

Probenvorbereitung                                                                                                                                                                 
Urin und insbesondere Plasma stellen sehr komplexe Probenmatrizes dar, die eine Vielzahl sehr unterschiedlicher Stoffgruppen wie beispielsweise Proteine, Peptide, Salze, Zucker, Lipide und Stoffwechselprodukte der Nahrung in sehr variablen zum Teil hohen Konzentration enthalten. Um in diesen Mischungen geringste Spurenkonzentrationen der CKS (Analyten) nachweisen zu können, ist es unabdingbar, eine Vorreinigung der Analyten durchzuführen. Zu diesem Zweck werden unterschiedliche Extraktionen vorgenommen, die die Reinigung und Aufkonzentrierung der Analyten erlauben. Die gemeinhin bekannte flüssig-flüssig Extraktion (Ausschütteln mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbarem Lösungsmittel) stellt hierzu nur eine mögliche Variante dar. Häufig kommen alternativ Festphasenextraktionen, Immunpräzipitationen oder affinitätschromatographische Schritte zur Anwendung, auf deren detaillierte Darstellung an dieser Stelle jedoch verzichtet sei.

Trennung
Auch wenn die Probenvorbereitung typischerweise konzentriertere und weniger verunreinigte Analytlösungen produziert, ist dennoch häufig eine Trennung der Analyten von verbliebenen Komponenten erforderlich. Dazu wird das Probengemisch beispielsweise auf eine Säule injiziert, die ein spezielles Material enthält, das die Bestandteile unterschiedlich stark bindet (stationäre Phase). Werden nun ein Flüssigkeitsstrom (Flüssigchromatographie, LC) oder ein Gasstrom (Gaschromatographie, GC) angelegt (mobile Phase), lassen sich die Probenkomponenten in zeitlicher Abfolge von der Säule eluieren und somit trennen, um anschließend direkt detektiert zu werden. Die Elutionszeit (Retentionszeit) dient dabei als ein Identifizierungskriterium (Abb. 3,4).

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Detektion
Die valide Detektion der Spuren an CKS und ihren Abbau- und Reaktionsprodukten erfordert sowohl eine selektive wie auch hoch sensitive Technik. Diese Ansprüche werden von moderner Massenspektrometrie (MS) erfüllt, die in on-line Kopplung mit GC und LC weite Verbreitung in der Analytik gefunden hat. Ein Optimum an Selektivität (Detektion genau eines bestimmten Analyten unbeeinflusst von anderen Probeninhaltsstoffen) ermöglicht die Tandem-MS (MS/MS). Abbildung 3 illustriert exemplarisch die Messergebnisse (Chromatogramme) der GC-MS (Abb. 3B) und LC-MS/MS Analysen (Abb. 3C) von Kampfstoffgemischen und ihren Abbauprodukten in Plasma und Urin. Wie im Leistungsverzeichnis des Qualitätsmanagementsystems von InstPharmToxBw aufgeführt, verfügt das Institut über Massenspektrometrie-basierte Methoden zum Nachweis der Nervenkampfstoffe des G-Typs (Tabun, Sarin, Soman, Cyclosarin) und des V-Typs (VX, chinesisches und russisches VX) sowie zum Nachweis des Hautkampfstoffes Schwefellost und ihrer Hydrolyseprodukte.
Die langlebigsten Marker einer CKS Inkorporation stellen jedoch die Addukte mit Proteinen dar. NKS lassen sich beispielsweise als Addukte der zirkulierenden BChE oder des Albumins erfassen. Um diese mittels moderner LC-MS/MS Verfahren nachzuweisen, werden in einem initialen Schritt die Proteine selektiv aus dem Plasma isoliert. Anschließend wird durch Zugabe einer geeigneten Protease (Schneideenzym wie beispielsweise Pepsin für BChE und Pronase für Albumin) das intakte kampfstofftragende Protein gespalten, um kleine peptidische Produkte zu erhalten. Dieses Reaktionsgemisch wird anschließend über LC-MS/MS getrennt und detektiert. Da der CKS auch an Peptid-Spaltprodukten stabil gebunden bleibt, lässt er sich über seinen charakteristischen Massenzuwachs eindeutig nachweisen (Abb. 4).

Die Leistungsfähigkeit dieser Methodik konnte jüngst in einer Übung der OVCW unter Beweis gestellt werden. Bei dieser Übung (4. Biomedical Confidence Building Exercise) gelang es InstPharmToxBw zu beweisen, dass dem Plasma zuvor geringste Mengen der Nervenkampfstoffe VX und Soman (1 - 5 ng/ml) zugesetzt waren (Abb. 4B). Die entsprechenden Konzentrationen wären in vivo deutlich unterhalb einer letalen Dosis gewesen. So dokumentierten die Resultate, dass die gewählte Methodik auch zum Nachweis nicht tödlich wirkender Expositionen einsetzbar ist. Ein weiteres sehr effizientes Verfahren, das zum Nachweis des NKS die Präsenz von Proteinaddukten nutzt, ist die Fluorid-induzierte Reaktivierung. Auf eine weitergehende Darstellung soll an dieser Stelle jedoch verzichtet werden.
Am InstPharmToxBw ist eine wachsende Zahl analytischer Methoden zur Verifikation etabliert. Die Qualität dieser Verfahren ist durch die Akkreditierung der Deutschen Akkreditierungsstelle (DAkkS) nach der Norm DIN/EN/ISO 17025 für forensisch-toxikologische Laboratorien dokumentiert. Das etablierte Qualitätsmanagementsystem regelt jedoch nicht nur die Durchführung dieser Spezialmessungen, sondern umfasst zudem die Organisationsstruktur des InstPharmToxBw sowie die Grundlagen für die zusätzliche Akkreditierung nach DIN/EN/ISO 15189 für medizinische Laboratoriumsdiagnostik. Neben der nationalen Anerkennung der Analysenqualität wird die Leistungsfähigkeit der bioanalytischen Methoden in regelmäßigen Ringversuchen der OVCW unter Beweis gestellt. Die ausführlichen Berichte über die Analysenergebnisse werden der Organisation zur Auswertung zugestellt. Diese Übungen dienen der Vorbereitung auf den Realfall, wenn der Verdacht besteht, dass in Krisenregionen tatsächlich chemischer Kampfstoff eingesetzt wurde.
Um somit den wachsenden Ansprüchen an Umfang, Empfindlichkeit und Selektivität der Spurenanalytik auch weiterhin gerecht werden zu können, muss das InstPharmToxBw mit modernsten analytischen Instrumenten ausgestattet sein. Diese lassen sich darüber hinaus ebenfalls zielgerichtet in der Entwicklung neuer Antidote und Therapien sowie zur Aufklärung von Vergiftungsmechanismen einsetzen.

Datum: 11.11.2014

Quelle: Wehrmedizin und Wehrpharmazie 2014/3