Artikel: Wehrmedizinische Monatsschrift 1/2019

Etablierung einer genexpressionsbasierten Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik der hämatologischen akuten Strahlenkrankheit

Matthäus Majewski

Aus der Arbeitsgruppe „Genomics“ (Arbeitsgruppenleiter: Oberstarzt Prof. Dr. M. Abend) des Instituts für Radiobiologe der Bundeswehr (Institutsleiter: Oberstarzt Prof Dr. M. Port)

Zusammenfassung

Einführung: Radiologische und nukleare (R/N) Szenarien sind potentielle Großschadenslagen, die bei mehreren hunderten und tausenden betroffenen Personen zur Ausbildung einer hämatologischen akuten Strahlenkrankheit (HASK) führen können. Nach einem solchen Ereignis müssen so früh wie möglich vermeintlich bestrahlte („worried wells“) sowie niedrig und stark strahlenexponierte Menschen identifiziert werden.

Material und Methoden: Bei 18 Pavianen (Papio anubis) eines bei unserem französischen Partnerinstitut (Institut de Recherche Biomédicale des Armées (IRBA)) bereits laufenden Tierexperiments[1] wurden im Sinne eines „predictive assays“ Vollblutproben vor und ein sowie zwei Tage nach Teil- bzw. Ganzkörperbestrahlung – Wochen, bevor die Tiere an der akuten Strahlenkrankheit erkrankten – entnommen und dem Institut für Radiobiologie der Bundeswehr -(InstRadBioBw) zur Verfügung gestellt. Auf Grundlage der Blutbildveränderungen (7 bis 203 Tage nach Bestrahlung) wurde der Schweregrad der sich später entwickelnden HASK diagnostiziert. 

Über verschiedene Schritte wurden genexpressionsbasierte Marker mittels Ganz-Genome Mikroarrayanalyse und quantitativer real-time PCR im Blut identifiziert und in klinischen Modellen validiert.

Ergebnisse: Von insgesamt 866 potentiellen Genen wurden die 89 besten Kandidaten herausgearbeitet, die eine Identifizierung der HASK – innerhalb der ersten beiden Tage nach Bestrahlung – ermöglichten. 29 Gene ließen sich in einer unabhängigen und methodischen Validierung bestätigen. Insgesamt neun Gene wurden erfolgreich an den Vollblutproben von strahlenexponierten Patienten validiert (Übertragung auf ein klinisches Modell). Vorläufige Ergebnisse des Versuchs zur Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik bestätigen, dass durch Verwendung der identifizierten Kandidatengene der Durchsatz der aktuellen Diagnostik von zehn Proben innerhalb von 3 bis 4 Tagen (etablierte Verfahren) auf 1 000 Proben innerhalb von 24 Stunden (neues genexpressionsbasiertes Verfahren) erhöht werden kann.

Schlussfolgerungen: In jahrelangen, aufwändigen Untersuchungen, die ihren Beginn in einer NATO-Kooperation mit unserem französischen Schwesterinstitut in einem dort bereits laufenden Tierexperiment hatten, konnte eine strahleninduzierte Gensignatur identifiziert werden. Diese Gensignatur erlaubt innerhalb der ersten beiden Tage nach Bestrahlung eine Vorhersage der später auftretenden akuten Strahlenkrankheit. Damit können Patientinnen und Patienten, die später lebensgefährlich erkranken, frühzeitig hospitalisiert und einer optimalen Therapie zugeführt werden. Dies führt zu einer entscheidend verbesserten Prognose. In einer Reihe weiterer Experimente wurden die Ergebnisse validiert und ihr Potential als Hochdurchsatzdiagnostik gegenüber etablierten Verfahren herausgearbeitet. Diese Arbeiten bilden somit einen wichtigen Baustein zur Schließung der wehrmedizinischen Fähigkeitslücke der Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik der HASK.

Schlüsselwörter: Genexpression, hämatologischer Strahlenschaden, Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik, HASK

Summary

Introduction: Radiological and nuclear scenarios (R/N) are potential mass casualty situations with hundreds to thousands of people affected, developing a hematological acute radiation syndrome (HARS). An early medical management is needed to distinguish between people who only think of being affected (so called “worried wells”) and those actually exposed to a low or high radiation dose. 

Material and Methods: In 2014 blood samples from an already ongoing experiment were offered to our institute by the French Institut de Recherche Biomédicale des Armées (IRBA) as part of a French-German NATO-collaboration. 18 baboons (Papio anubis) were partially and whole-body irradiated. As predictive assay whole-blood samples were taken before and 1-2 days after irradiation, weeks before the animals developed the acute radiation syndrome. Later on, the grading of the HARS was determined based on blood cell counts 7-203 days after irradiation. In these blood samples different gene expression changes were detected by whole genome microarray analysis and quantitative real-time PCR and vali-dated against clinical models.

Results: From overall 866 potential genes the 89 best candidates for the identification of HARS during the first two days after irradiation were selected. Of these 29 were validated independently and methodically. A total of 9 genes were successfully validated on patient samples. 

Preliminary results confirm the applicability of this method as an early- and high throughput diagnostic tool which allows the processing of up to 1.000 samples within 24 h compared to 10 samples being analyzed within 3-4 days by using standard diagnostic procedures.

Conclusions: In a several year spanning series of experiments that started as a NATO-cooperation with our French partner institute based on material of an already running animal experiment we were able to identify a signature of radiation responsive genes. This signature allows an early prediction of the grade of a later developed HARS within the first two days after a radiation exposure. Hereby, patients exposed to a life-threatening dose of ionizing radiation might be hospitalized and treated faster – resulting in a realistic chance of a better medical outcome. Our results were validated in a clinical model and turned out to be useful as high-throughput diagnostic. Therefore, this work might help to close a skill gap in an important matter of military medicine: finding an early and high-throughput diagnostic tool for the prediction of HARS.

Keywords: gene expression, hematological acute radiation syndrome, HARS, high-throughput diagnostic

Einleitung

Hintergrund

PhotoAbb.1: Simulation der Oberflächendetonation einer improvisierten Nuklearwaffe (10 Kilotonnen) im Zentrum von München mit der Darstellung der Wirkkreise und des Fallouts [11] Durch die sich wandelnde internationale Sicherheitslage ist die Gefährdung durch radiologische und nukleare (R/N) Szenarien sowohl in der Wissenschaft [1], Politik [2] als auch im militärischen Kontext [3, 4] ein intensiv diskutiertes Thema. Die Reaktorunglücke Fukushima und Tschernobyl sind in der Öffentlichkeit noch immer präsent und haben zu einer umfassenden Sensibilisierung für das Thema der radionuklearen Gefährdung geführt.

R/N Szenarien umfassen neben Reaktorunglücksfällen auch den terroristischen oder militärischen Einsatz von Radionukliden oder Kernwaffen. 2009 wurde durch den damaligen US-Präsidenten Barack Obama der Nuklearterrorismus als eine der zentralen Bedrohungen für die internationale Sicherheit herausgestellt. Auf den „Nuklearen Sicherheitsgipfeln“ [2] wurde seitdem die zunehmende Gefährdung durch nuklearen Terrorismus diskutiert und es wurden Maßnahmen erarbeitet, um die Anwendung von Strahlenquellen als Waffe zu verhindern.

Die missbräuchliche Nutzung von Radionukliden durch Terroristen ist in vielfältiger Form vorstellbar. Angefangen bei der Nutzung als Gift wie im Fall Litvinenko [5] oder aber beim Einsatz als Radiological Exposure Devices (REDs) [6].

Szenarien, die zu Großschadensereignissen führen, sind leicht vorstellbar. Beim Einsatz einer sogenannten „schmutzigen Bombe“ werden Radionuklide mit einem konventionellen Sprengkörper vermengt. Dass selbst geringe Mengen an Radionukliden enorme Auswirkungen haben können, zeigte der Unfall von Goiânia (Brasilien) 1987. Nur 93 g Caesium-137 bewirkten, dass mehr als 100 000 Personen auf eine Kontamination untersucht werden mussten. Mehrere hundert Menschen wurden tatsächlich zum Teil stark radioaktiv kontaminiert und es kam zu vier Todesfällen [7].

Noch weitreichender könnten die Folgen eines terroristischen Angriffs auf ein Kernkraftwerk sein. Dabei sind sowohl „konventionelle“ Attacken (Angriffe mittels Verkehrsflugzeug oder Überfall) als auch Cyberangriffe – wie im Fall Iran und Stuxnet – vorstellbar [8].

Das „worst-case Szenario“ einer nuklearen terroristischen Bedrohung ist der Einsatz einer Kernwaffe. Bei der Oberflächenzündung einer improvisierten Kernwaffe (Improvised Nuclear Device, IND) in einem Ballungszentrum ist mit verheerenden Folgen zu rechnen [9-11]. Selbst bei der Detonation einer vergleichsweise kleinen Bombe mit 10 Kilotonnen Sprengkraft ist mit mehreren zehntausend Betroffenen und der Verstrahlung großer Areale zu rechnen (Abbildung 1).

Dass die missbräuchliche Aneignung von Radionukliden weniger abwegig ist als man zunächst vermuten mag, zeigt die „Incident and Trafficking Database“ (ITDB) der internationalen Atomenergiebehörde (IAEA) (12). Diese Datenbank dokumentiert tausendfach den unerlaubten Handel und die Nutzung sowie den Verlust von Strahlenquellen.

Über die Aspekte Unglücksfälle und Terrorismus hinaus ist auch ein möglicher militärischer Einsatz von Kernwaffen mit seinen fatalen Folgen fast 30 Jahre nach Ende des Kalten Krieges wieder wahrscheinlicher geworden. Das nordkoreanische Regime konnte sein Kernwaffenprogramm trotz internationaler Sank-tionen erfolgreich vorantreiben, und auch der Iran forciert den Aufstieg zur Atommacht.

Die USA zeigen ebenfalls deutliche Anstrengungen für eine Erneuerung und Erweiterung ihres Nuklearwaffenarsenals [13].

Diese Beispiele zeigen, wie vielgestaltig und zum Teil umfänglich sich R/N Szenarien darstellen können, bei denen mit einer Strahlenexposition von zum Teil mehreren zehntausend Personen gerechnet werden muss.

Die akute Strahlenkrankheit

Insbesondere bei den R/N Szenarien Kraftwerkshavarie oder dem Einsatz einer IND ist bei betroffenen Personen tausendfach mit dem Auftreten der akuten Strahlenkrankheit (ASK) zu rechnen [14]. Oberhalb von Strahlendosen (homogene, nicht frak-tionierte Ganzkörperexposition über einen kurzen Zeitraum) von etwa 2 Gy ist das Auftreten der akuten hämatologischen Strahlenkrankheit zu erwarten.

Grundsätzlich gibt es drei Möglichkeiten, um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer ASK abzuschätzen:

  • die Nutzung von klinischen Zeichen und Symptomen,
  • die Erhebung physikalischer Messdaten/Dosimetrie und
  • der Nachweis von biologischen Veränderungen, z. B. Veränderungen im Zellkern.

PhotoAbb. 2: Retrospektive Untersuchungen von realen Strahlenunfallopfern zeigen die eingeschränkte Eignung des Faktors Dosis für die Abschätzung des hämatologischen Strahlenschadens im Bereich zwischen 1 und 5 Gy [15]. Klassischerweise wird über die Erhebung dieser Werte eine Dosisabschätzung durchgeführt, welche dann in einem zweiten Schritt zu einer Abschätzung der Krankheitswahrscheinlichkeit genutzt wird. Alternative Ansätze fokussieren sich auf eine direkte Effektabschätzung ohne den Umweg der Dosisrekon-struktion, da sich insbesondere im Bereich 1 bis 5 Gy eine eingeschränkte Effektprädikation über die Dosis gezeigt hat (Abbildung 2) [15].

Für die Anwendung physikalischer Messdaten ist entweder die Dosisrekonstruktion oder die Nutzung von Dosimetern notwendig. Im Falle eines unerwarteten Ereignisses wie einem Terroranschlag ist allerdings nicht davon auszugehen, dass Personen mit Dosimetern ausgestattet sein werden.

Die Nutzung von klinischen Zeichen und Symptomen, etwa die Frequenz und der Beginn von Erbrechen und Durchfall, könnten insbesondere für die schnelle radiobiologische Triage von großen Personengruppen sinnvoll sein, auch wenn sie nur einen ersten groben Anhalt liefern können [16, 17] und als nicht-strahlenspezifisch betrachtet werden müssen.

Als Goldstandard für die biologische Dosimetrie hat sich die dizentrische Chromosomenanalyse (DCA) etabliert [18]. Sie weist eine hohe Spezifität und Sensitivität auf, bleibt viele Monate nach einer Bestrahlung positiv, ist in der Lage, auch niedrige Dosen ab 100 mGy nachzuweisen und ist in vielen Labors weltweit harmonisiert. Große Nachteile des Verfahrens sind Aufwand und Dauer der Analyse, die mehrere Tage beträgt [19]. Die Methode ist für eine schnelle Triage somit, trotz einer guten Vernetzung der Speziallabore, eher ungeeignet [20].

Bei R/N Szenarien mit sehr hohen Patientenzahlen wird ein möglichst frühes und zielgerichtetes medizinisches Management mit dem Fokus auf klinisch relevante Fragestellungen notwendig sein, um das bestmögliche Behandlungsergebnis für viele Betroffene erreichen zu können [10, 21]. Diese klinisch relevanten Aspekte umfassen die Frage nach einer Hospitalisierung, der Notwendigkeit einer intensivmedizinischen Therapie und nach der Einleitung von medizinischen Gegenmaßnahmen [22]. Diese Punkte hängen maßgeblich von der frühen Abschätzung des zu erwartenden HASK-Schweregrads ab.

Molekularbiologische Verfahren haben das Potenzial, diese Effektabschätzung früh und in einem hohen Durchsatz vornehmen zu können [19]. Genexpressionsanalysen beispielsweise lassen sich – von der technologischen Seite her gesehen – einfach automatisieren und parallelisiert durchführen. Zahlreiche Forschungsgruppen konnten in den letzten beiden Dekaden bereits potenzielle, genexpressionsbasierte Biomarker identifizieren [23-30].

Zielsetzung

Diese Arbeit fasst die Ergebnisse jahrelanger kontinuierlicher Untersuchungen, beginnend mit Tierexperimenten[2], der Validierung im klinischen Modell bis hin zur Demonstration einer darauf aufbauenden Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik zusammen. Sie thematisiert eine entscheidende wehrmedizinische Fähigkeitslücke im Bereich des medizinischen A-Schutzes. Es werden sehr vielversprechende Ansätze bis hin zur „Point-of-Care“ Diagnostik.

Material und Methoden

Identifizierung von Kandidatengenen

Tiere und Bestrahlung

Durch das Institut de Recherche Biomédicale des Armées (IRBA) in Frankreich wurden 18 Paviane (Papio anubis) verschiedenen Mustern einer Ganzkörper- (Total Body Irradiation, „TBI“) und Teilkörperbestrahlung (Partial Body Irradiation, „PBI“) (Äquivalent-Ganzkörperdosis zwischen 2,5 und 5 Gy) ausgesetzt. Vier Tiere erhielten eine TBI und 16 Tiere eine PBI (je zwei mit dem gleichen Muster). Für die Bestrahlung wurde eine Cobalt-60 Quelle genutzt [31].

Die Experimente wurden durch die Ethikkommission der französischen Armee geprüft und gebilligt (Nummer 2010/12.0). Die Tiere wurden gemäß Europäischer Gesetzgebung in Bezug auf Tierpflege und Tierschutz behandelt. Durch einen Tierarzt wurden supportive Maßnahmen zur Minimierung von Angst, Schmerz und Stress sichergestellt. Im Rahmen einer NATO Forschungsgruppe stellten die Franzosen ihr Modell vor und boten uns die Beteiligung an den laufenden Experimenten an.

Blutentnahme und Bestimmung des akuten hämatologischen Strahlensyndroms 

Veränderungen im Differentialblutbild an bis zu 22 Zeitpunkten zwischen Tag 7 und 203 nach Bestrahlung wurden genutzt, um den HASK Schweregrad zu definieren [32]. Grundlage hierfür waren die METREPOL[3] Kriterien (H0: nicht-exponiert; H1-4: niedrig bis tödlich bestrahlt) [14]. Die Blutentnahmen (PAXgene Blood RNA Tubes, PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Schweiz) für die Genexpressionsanalysen erfolgten an Tag 0 (vor Bestrahlung, H0) sowie an Tag 1 und 2 nach Bestrahlung.

RNA Isolation und Qualitätskontrolle 

2,5 ml Vollblut in PAXgene Röhrchen wurden im IRBA gemäß Anleitung des Herstellers entnommen, bei -20 °C gelagert und im Anschluss gefroren zur weiteren Bearbeitung an das Institut für Radiologie der Bundeswehr (InstRadBioBw) versendet. Die Isolation der Gesamt-RNA (mRNA und smallRNAs) erfolgte über die Kombination einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dem mirVana™ Total RNA Isolation Kit (Thermo Fischer Diagnostics, Darmstadt, Deutschland). Während der Isolation wurde ein DNA-Verdau durchgeführt (RNAse free DNAse Set; Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Qualität und Quantität wurden spektralphotometrisch überprüft (NanoDrop; PeqLab Biotechnologie, Erlangen, Deutschland). Die RNA-Integrität (RNA Integrity Number, RIN) wurde mittels Agilent 2100 Bioanalyzer (Life Science Group, Penzberg, Germany) gemessen und eine DNA Kontamination durch eine konventionelle PCR mit beta-Aktin Primern ausgeschlossen. RNA Proben mit einem A260/A280 Verhältnis von ≥ 2,0 (NanoDrop) und einer RIN ≥ 7,5 wurden für das Whole Genome Microarray Screening (IMGM® Laboratories, Martinsried, Germany) und mindestens mit RIN ≥ 7,3 für die qRT-PCR verwendet [32].

Schritt 1: Ganzgenomanalyse mittels Mikroarray

Anhand von 23 RNA Proben (H0, n = 5; H1-2, n = 2 x 4 an Tag 1 und 2 nach Bestrahlung; H2-3, n = 2 x 5, an Tag 1 und 2 nach Bestrahlung) wurde eine Ganzgenomanalyse (Whole Genome Microarray Screening) zur Untersuchung der proteinkodierenden mRNAs durchgeführt. Als Plattform wurde das Agilent Oligo Microarray GE 8 x 60 K (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) System in Kombination mit der GeneSpring GX12 Software verwendet. Der nicht-parametrische Mann-Whitney-Test wurde für den Vergleich der Genexpression zwischen H1-2 und H2-3 mit der H0 Referenzgruppe verwendet. Für die Auswahl der Kandidatengene zur Validierung wurden Transkripte gewählt, die in 50 % der Einzelproben exprimiert waren sowie einen p-Wert von ≤0,05 und eine ≥2-fold differentielle Genexpression zwischen den untersuchten Gruppen aufwiesen [32].

Schritt 2: Validierung des Mikroarray Screenings mittels qRT-PCR 

Die identifizierten Gene aus dem Schritt 1 wurden unabhängig (23 bislang nicht verwendete RNA Proben) und methodisch (35 RNA-Proben) mittels TaqMan™ Low-Density Array (Hochdurchsatz 384-Well qRT-PCR Plattform) validiert. Dazu wurde 1 µg RNA mittels High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt. Die Reaktion und das gleichzeitige Auslesen der Expressionsdaten erfolgte mittels eines Applied Biosystems 7900 qRT-PCR Geräts. Die Genexpression wurde gegen das Haushaltsgen 18S normalisiert. Ein Unterschied der normalisierten Genexpression um den Faktor ≥2 gegenüber der Referenzgruppe wurde als differentielle Genexpression definiert („Fold Change“). Alle Reagenzien und Geräte wurden von der Firma Life Technologies (Darmstadt) bezogen [32].

Bioinformatische Analyse

Gene aus dem Screening mit einem p-Wert ≤0,05 und einer ≥2-fach differenziellen Genexpression wurden mittels PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relation-ships), (v10; http://www.pantherdb.org/), auf Gemeinsamkeiten in der biologischen Funktion analysiert (Referenz Homo Sapiens GO Datenbank).

Die qRT-PCR Daten wurden zur Validierung der Mikroarraydaten verwendet. Die Genexpressionsmessungen wurden auf ihre Assoziation mit klinisch relevanten Kategorien mittels logistischer Regressionsanalyse wie folgt untersucht:

  • kein HASK (H0) gegen alle Formen des HASK (H1-3),
  • kein HASK (H0) gegen leichtes HASK (H1-2) und
  • kein HASK gegen schweres HASK (H2-3).

Neben deskriptiver Statistik wurden Odds-Ratios, 95 % -Konfidenz-Intervalle (CI) sowie korrespondierende p-Werte (Wald-Test) berechnet. Zur Bestimmung der diagnostischen Genauigkeit berechneten wir die Fläche unter der Receiver--Operating--Characteristic (ROC) Kurve. Alle Berechnungen erfolgten mit SAS Version 9.2 (SAS Institute, Cary, NC).

Validierung im Menschen und Übertragung auf einen ex vivo in vitro Hintergrund

Um die Übertragbarkeit der Ergebnisse vom Pavian auf den Menschen zu prüfen, wurden in vivo Vollblutproben von Patienten, die eine diagnostische oder therapeutische Strahlenexposition erhielten, untersucht (Abbildung 3). Dabei wurden je fünf Patienten nach einer Computertomographie-Diagnostik (Dosisbereich 0,004-0,018 Sv), fünf Patienten nach einer Teilkörperbestrahlung auf Grund eines Prostatakarzinoms (Dosisbereich 0,25-0,3 Sv), sowie fünf Patienten nach einer Ganzkörperbestrahlung auf Grund einer Leukämie (Dosisbereich 2 × 1,5 oder 2 × 2 Sv) betrachtet. Es wurde die differentielle Genexpression von sechs, zuvor im Pavian-Modell identifizierten (WNT3, POU2AF1, CCR7, ARG2, CD177, WLS) sowie drei weiteren, häufig genutzten strahlensensiblen Genen (FDXR, PCNA, DDB2) untersucht. Weiterhin wurde die Übertragbarkeit der in vivo Genexpressionsergebnisse auf ein ex vivo in vitro Modell sowohl beim Pavian wie auch beim Menschen mittels ex vivo bestrahlter Blutproben (EDTA-Blut, n = 5 Pavian und n = 6 Mensch) von gesunden Individuen überprüft (Abbildung 3). Methodisch kam die qRT-PCR zur Anwendung [33].

Definition der Genexpressionsniveaus in einem Normalkollektiv

PhotoAbb 3: Schematische Darstellung der Validierung zwischen Pavian und Mensch „cross-species“ mittels in vivo und ex vivo in vitro Experimente und der Validierung zwischen ex vivo in vitro und in vivo innerhalb der jeweiligen Spezies („intra-species“) [33] Um das basale Expressionslevel der Gensignatur (DAGLA, WNT3, CD177, PLA2G16, WLS, POU2AF1, STAT4, PRF1, FDXR und DDB2) und den Einfluss der interindividuellen Varianz zu bestimmen, wurden von 200 nicht-strahlenexponierten Personen (122 männlich und 88 weiblich, Durchschnittsalter 46 Jahre) Vollblutproben in PAXgene Röhrchen entnommen. Das Kollektiv rekrutierte sich aus gesunden, freiwilligen Blutspendern des Bayerischen Roten Kreuzes. Die Probenbearbeitung erfolgte mittels robotischer RNA Isolation (QIAsymphony, Qiagen, Hilden, Deutschland) und anschließender qRT-PCR. Die Ergebnisse wurden auf die Diskriminierungsfähigkeit gegenüber den HASK Pavian Gruppen geprüft [34].

Umsetzung als Früh- und Hochdurchsatzdiagnostikum

Aktuell wird die Umsetzbarkeit der zuvor identifizierten und analysierten Gene in einem Früh- und Hochdurchsatzsetting untersucht. Hierzu wurde ex vivo in vitro entnommenes Blut bestrahlt (0 bis zu 5 Gy), verblindet und in 1 000 Einzelproben aliquotiert. Ziel ist es, als „proof of principle“ die parallelisierte, robotische RNA Isolation (QIAsymphony, Qiagen, Hilden, Deutschland) und die anschließende Genexpressionsanalyse mittels einer Sequenzierung der nächsten Generation (Next Generation Sequencing, NGS) inklusive Ergebnisbewertung innerhalb von 24 Stunden durchzuführen (Abbildung 4). Als Endpunkt wurden klinisch relevante Fragestellungen definiert (Identifizierung von nicht-exponierten Proben gegenüber exponierten Proben; Separation leichte von schwerer HASK).

Ergebnisse

Initiale Studie

Abbildung 5 liefert einen Gesamtüberblick über das zweistufige experimentelle Setting der initialen Studie, die Verteilung der Proben auf die einzelnen Stadien sowie einen Überblick über die verwendeten Analyseverfahren und Ergebnisse [32].

HASK Schweregradeinteilung

PhotoAbb. 4: Workflow des Experiments zur Prüfung der Früh- und Hochdurchsatznutzbarkeit von Genexpressionsveränderungen. Blut wurde ex vivo entnommen, in vitro bestrahlt (bis zu 5 Gy) und verblindet. Die Proben werden robotisch innerhalb von 12 Stunden isoliert und innerhalb weiterer 12 Stunden mittels Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) analysiert. (Bilder: InstRadBioBw/ Quiagen/Pixabay/PresenterMedia) Auf Grundlage der METREPOL Kriterien [14] wurden die untersuchten Tiere in klinisch relevante Schweregradkategorien der HASK eingeteilt. Da die Ergebnisse der untersuchten Einzelwerte (Blutplättchen, Lymphozyten und Neutrophile) teils inkonsistent waren (z. B. H1 auf Basis der Blutplättchen und H2 auf Basis der Lymphozyten), wurden Mischgruppen (H1-2 und H2-3) definiert. Letztlich wurde 17-mal H0 (vor Bestrahlung), 4-mal H1-2 und 13-mal H2-3 (je nach Bestrahlung) vergeben. Eines der 18 Tiere wurde auf Grund eines ungewöhnlichen klinischen Verlaufs und frühzeitigen Exitus von der Studie ausgenommen.

Ergebnisse Schritt 1: Whole Genome Mikroarray Screening

Von insgesamt etwa 20 000 untersuchten Genen waren im Durchschnitt 46 % exprimiert. Für die H2-3 Gruppe zeigten sich 2 bis 3-mal mehr hoch- und herunterregulierte Gene an Tag 1 als für die H1-2 Gruppe (1 418 gegen 550 und 1 603 gegen 735). An Tag 2 konnte eine weitere Zunahme dieser Tendenz bei einer gleichzeitigen Abnahme der Gesamtzahl der differentiell-exprimierten Gene beobachtet werden (Abbildung 6). Bei einer nur geringen Überlappung zwischen H1-2 und H2-3 (91 hoch- und 169 herunterregulierte Gene) verblieben 692 hoch- und 174 herunterregulierte Kandidatengene für eine Differenzierung der beiden Gruppen voneinander. Mittels PANTHER konnte eine Verflechtung der Kandidatengene in immunologische Prozesse gezeigt werden [32].

PhotoAbb. 5: Übersicht über Material und Methoden sowie Ergebnisse aus der initialen zweigliedrigen Studie zur Identifizierung einer Signatur zur Vorhersage des hämatologischen akuten Strahlensyndroms (HASK) [32] Grundlage für die Auswahl an Kandidatengenen waren der p-Wert und die Höhe des „Fold Change“, sowie eine Nachweisbarkeit sowohl an Tag 1 und 2 nach Bestrahlung. Die Auswahl belief sich letztendlich auf insgesamt 89 Kandidatengene (H1-2 = 69 und H2-3 = 20).

Ergebnisse Schritt II: Validierung mittels qRT-PCR

Von den 89 ausgewählten Genen zeigten 47 keine Amplifikation in der qRT-PCR; 13 Gene zeigten niedrigere oder weniger konstante „Fold Changes“ als im Mikroarray. Die verbliebenen 22 Gene konnten mittels qRT-PCR für eine Unterscheidung zwischen nicht-exponiert (H0) und exponiert (H1-3) bestätigt werden. Die analysierten „Fold Changes“ befanden sich überwiegend im Bereich 3-5, für einzelne Gene, aber auch zum Teil deutlich darüber hinaus (CD177; 30,7-fach hochreguliert). Als Maß für die diagnostische Genauigkeit zeigte sich bei drei Genen eine ROC-Fläche[4] von 1 als Zeichen einer kompletten Separation (mittlerer ROC Wert für alle 22 Gene = 0,93) [32].

Für die Diskriminierung einer schwereren Verlaufsform des HASK (H2-3) konnten 7 Gene gefunden werden, mit einer bis zu 30-fachen Deregulation (WNT3) (Abbildung 7). Eine komplette Separation ließ sich ebenfalls bei drei Genen zeigen (ROC 1; Mittlerer ROC Wert für alle 7 Gene = 0,93) [32].

Validierung im Menschen

PhotoAbb. 6: Venn-Diagramme zeigen die Gesamtzahl der hoch- und runterregulierten Gene nach Bestrahlung am Tag 1 und 2 für die Gruppen H1-2 und H2-3 sowie die Überschneidung [32]. Bei der Analyse der in vivo und ex vivo in vitro Ergebnisse („cross-species“ Validierung Abb. 8 A und B) zeigte FDXR eine inverse Regulation zwischen Mensch und Pavian, trotz einer beachtlichen Homologie zwischen den beiden Spezies (35). DDB2 und PCNA wiesen eine im Trend gleichsinnige Regulation auf. WNT3, POU2AF1 und CCR7 zeigten eine Herunterregulation sowohl in Menschen als auch in Pavianen bei Dosen > 2 Sv. Für ARG2, CD177, WLS bestätigte sich eine Hochregulation im Mittel für die fünf Leukämiepatienten [33].

Der Vergleich der in vivo Ergebnisse mit Messungen aus einem ex vivo in vitro Vergleich („intra-species“ Validierung) offenbarten bei Pavian und Mensch für FDXR, PCNA, DDB2, WNT3 und POU2AF1 eine Dosis-Wirkungs-Beziehung. Für CCR7, ARG2, CD177 und WLS fanden sich abweichende Expressionsmuster (Daten nicht gezeigt) [33].

PhotoAbb. 7: Exemplarische Darstellung der Kandidatengene in den Mikroarray (linke Spalte) und qRT-PCR (rechte Spalte) Ergebnissen. Es zeigt sich eine zum Teil vollständige Diskriminierung zwischen den HASK Gruppen H0 und H2-3 in den zwei ersten Tagen nach Bestrahlung (POU2AF1 und WNT3) [32]. Bestimmung des basalen Genexpressionsniveaus in einem Normalkollektiv

Anhand der 122 männlichen und 88 weiblichen Blutspender (Durchschnittsalter 46 Jahre) wurde die interindividuelle Varianz der Genexpression für DAGLA, WNT3, CD177, PLA2G16, WLS, POU2AF1, STAT4, PRF1, FDXR und DDB2 in einem gesunden Normalkollektiv bestimmt. Diese Werte wurden als – um den Faktor 10 größere H0 Gruppe – für einen Vergleich mit den klinischen HASK Gruppen aus dem vorangegangenen Experiment genutzt. Es zeigte sich trotz einer zum Teil hohen interindividuellen Varianz eine weiterhin sehr gute Diskriminierbarkeit mit zum Teil vollständiger Separation zwischen H0 und H2-3 (WNT3, Abb.9) [34].

Umsetzung als Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik

Der in Abbildung 4 dargestellte experimentelle Ansatz zur Etablierung einer Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik wird aktuell bearbeitet, um die Hochdurchsatzfähigkeit von Genexpressionsanalysen in einem kurzen Zeitraum zu erproben. Zum aktuellen Zeitpunkt wurde bereits die Probengenerierung finalisiert und die robotische Isolation von 1 008 Proben innerhalb von 12 Stunden durchgeführt. Ausstehend ist die Analyse mittels gezieltem NGS.

Diskussion

Die dargestellten Ergebnisse zeigen den aktuellen Stand der Entwicklung einer genexpressionsbasierten Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik des HASK. Im Rahmen von R/N Großschadenslagen könnte diese neue Diagnostik eine zentrale Rolle für das medizinische Management von strahlenexponierten Personen darstellen. In einem mehrstufigen Konzept wurde auf Grundlage von tierexperimentellen Daten ein Genexpressionsmuster identifiziert [32] und mittels diagnostisch und/oder therapeutisch strahlenexponierter Patienten erfolgreich im Menschen validiert [33]. Gleichzeitig konnten die in vivo Ergebnisse auf ein ex vivo in vitro Zellkultur-Setting übertragen werden [33]. Zusätzlich wurde die interindividuelle Varianz der strahlensensiblen Kandidatengene in einem großen Normalkollektiv bestimmt (34). Aktuell wird die praktische Umsetzung in einem Früh- und Hochdurchsatzsetting anhand von 1 008 Blindproben getestet, die innerhalb von 24 Stunden isoliert und analysiert werden.

Bemerkenswert ist bei unserem Ansatz, dass es sich nicht um ein klassisches biodosimetrisches Konzept handelt. Durch zahlreiche Forschungsgruppen konnte bereits in der Vergangenheit gezeigt werden, dass es zu strahleninduzierten Genexpressionsveränderungen kommt [23-30]. In unserem Fall wird aber ein zur Biodosimetrie komplementärer Ansatz genutzt, der keine Abschätzung der Dosis, sondern der Krankheitseffekte verfolgt [15]. Es ergeben sich für die radiobiologische Diagnostik Vorteile, da durch eine Effektabschätzung über Genexpressionsänderungen Faktoren wie Strahlenqualität (Verhältnis Gamma- zu Neutronenstrahlung), Ganzkörper/Teilkörperbestrahlung, Fraktionierung, individuelle Radiosensitivität, Inkorporation, usw. direkt integriert werden.

Klinische Aspekte

PhotoAbb. 8: Darstellung des „cross species“ Vergleichs in vivo (A) und ex vivo in vitro (B) zwischen Pavian und Mensch an Hand der differentiellen Genexpression („Fold Change“ relativ zur nicht-exponierten Vergleichsgruppe) der strahlensensiblen Gene FDXR, PCNA, DDB2, WNT3, POU2AF1, CCR7, ARG2, CD177 und WLS für unterschiedliche Dosisbereiche; Signifikanzniveaus: * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,005; Fehlerbalken zeigen den Standardfehler. Das klassische Modell, nach dem für die behandelnden Mediziner durch Physiker oder Strahlenbiologen eine Strahlendosis rekonstruiert wird, setzt zusätzlich voraus, dass der/die behandelnde Arzt/Ärztin Erfahrung in der Abschätzung deterministischer Strahlenschäden auf Grund von hohen Strahlendosen hat. Defacto ist dies aber nur für Ärztinnen und Ärzte spezieller Fachrichtungen wie Hämatoonkologie und Strahlentherapie anzunehmen, von denen es in Deutschland nur eine begrenzte Anzahl gibt.

Die Endpunkte unseres Ansatzes sind klinisch relevante Fragen, konkret etwa die Identifizierung der Personen, die keine Strahlendosis erhalten haben, sogenannte „worried wells“ (H0 nach METREPOL) und somit keinerlei weitere Behandlung benötigen. Weiter sind die zu identifizieren, bei denen sich eine leichte Verlaufsform des HASK entwickeln wird (H1-2) und diejenigen, bei denen eine schwere HASK Verlaufsform zu erwarten ist (H3-4). Mit diesem Ansatz lässt sich zum einen auf die psychologischen Belange der zahlreichen zu erwartenden „worried wells“ eingehen (frühe Diagnosestellung), und zum anderen lassen sich die begrenzten Krankenhausressourcen sinnvoll nutzen (stationäre Behandlungsoptionen und insbesondere Überwachungskapazitäten bei schweren HASK Verlaufsformen). Zusätzlich unterstützt diese frühe Entscheidungsfindung die zeitgerechte Applikation von Gegenmaßnahmen, wie z. B. eine Dekorporationstherapie nach Radionuklidinkorporation [36] oder die Gabe von Zytokinen [22], die möglichst zeitnah (innerhalb von 48 Stunden nach dem Ereignis) erfolgen sollten. Diesem zeitkritischen Aspekt wird der Goldstandard der Biodosimetrie, die dizentrische Chromosomenanalyse nicht gerecht, da sie als wesentlichen Schritt die mehrtägige Kultivierung von Lymphozyten beinhaltet [19].

Auch ein Hochdurchsatz mit mehreren 1 000 Patientenproben lässt sich trotz etablierter Biodosimetrie-Netzwerke aktuell nicht realisieren [20]. Bisherige Ringversuche mit Blindproben haben nur wenige Einzelproben (bis zu 10 Proben) untersucht [19, 37, 38]. Unser Ansatz zielt darauf ab, dies um den Faktor 100 zu steigern und gleichzeitig das Zeitfenster um den Faktor 4 zu reduzieren, um eine Großschadenslage realistischer nachzubilden.

Limitationen

PhotoAbb. 9: Einfluss der interindividuellen Genexpressionsvarianz (Mensch) auf die Diskriminierungsfähigkeit zu den klinischen Effektgruppen (Pavian), hier am Beispiel gen WNT3: Trotz der deutlich erhöhten Varianz der um den Faktor 10 größeren H0 Gruppe im Menschen (rechte Seite) lässt sich weiterhin eine vollständige Diskriminierung zur H2-3 Gruppe erzielen. Der rote Strich markiert die 95 % Perzentile der humanen H0-Werte [34]. Auch wenn unsere Studie vielversprechende Ergebnisse zeigt, hat sie Limitierungen. Neben der noch ausstehenden Früh- und Hochdurchsatzerprobung ist insbesondere die Validierung auf Grundlage von strahlenexponierten Leukämiepatienten kritisch zu sehen. Die Gesamtanzahl der Hochdosis-Patientenproben ist gering (n = 5). Tatsächlich hat sich die Rekrutierung von geeignetem Probenmaterial als sehr schwierig und langwierig erwiesen. Die 5 Proben wurden in zwei strahlentherapeutischen Zentren in Deutschland und Tschechien in einem Zeitraum ≥ 12 Monaten gesammelt. Eine Erhöhung der Anzahl und die Validierung an akzidentell-strahlenexponierten Personen könnte die Robustheit des Verfahrens in Zukunft steigern.

Des Weiteren muss die Grunderkrankung der Patientinnen und Patienten betrachtet werden. Für WNT3 beispielsweise zeigt sich eine 57-fache Herunterregulation vor Bestrahlung in den Leukämiepatienten gegenüber dem Normalkollektiv [33, 34]. Dies erklärt die Überlegung, differenzielle Genexpression anstatt einfacher, normalisierter Genexpressionswerte zu betrachten.

Ausblick

Als ein weiterer Ausblick könnte eine genexpressionsbasierte qRT-PCR Diagnostik als „Point-of-Care“ Konzept (patientennahe Labordiagnostik) umgesetzt werden [39]. „Microfluidic“-Technologie ermöglicht eine chip-basierte Durchführung komplexer Laborverfahren in miniaturisierten Geräten. Dies könnte beispielsweise einen „forward deployable“ Einsatz in einem zivilen, katastrophenmedizinischen Kontext ermöglichen und die HASK-Diagnostik durch die vereinfachte Logistik noch zusätzlich beschleunigen. Weiterhin ist diese „Point-of--Care“-Diagnostik als eine konzeptionell sinnvolle Ergänzung zum Ansatz eines „Medical Radiological Incident Investigation Team“ (MED-RIIT) zu sehen, der gemäß NATO STANAG 2873[5] gefordert wird [40].

Zusammenfassend zeigt sich, dass Genexpression – trotz aller Limitierungen – zukünftig die Lücke in Bezug auf eine frühe und hochdurchsatzgeeignete Diagnostik des HASK schließen könnte. In weiterer Zukunft könnte sich hieraus sogar eine „Point-of-Care Diagnostik“ für den hochmobilen, zivilen und militärischen Einsatz von Genexpressionsanalysen zur HASK Diagnostik nach R/N-Szenarien entwickeln lassen.

Kernaussagen

  • Militärische und zivile radiologische und nukleare Szenarien sind mögliche Großschadenslagen mit mehreren 1 000 potenziell strahlenexponierten Personen.
  • Die aktuellen Diagnostika der hämatologischen akuten Strahlenkrankheit weisen Lücken bei der Früh- und Hochdurchsatznutzbarkeit auf.
  • Mittels einer Gensignatur lässt sich die später auftretende hämatologische akute Strahlenkrankheit innerhalb der ersten zwei Tage nach einem Bestrahlungsereignis diagnostizieren.
  • Mittels eines genexpressionsbasierten Verfahrens werden aktuell 1 000 bestrahlte Proben innerhalb nur eines Tages prozessiert und analysiert.
  • Zukünftig könnte das neue Verfahren auch als „Point-of-Care“ Konzept für eine patientennahe Labordiagnostik genutzt werden.


Literatur

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  40. NATO-STANAG 2873: COMMANDER’S GUIDE TO MEDICAL OPERATIONS IN SUPPORT OF CBRN DEFENSIVE OPERATIONS. NATO, 2018.


Danksagung

Die vorliegende Arbeit ist das Ergebnis einer jahrelangen, fruchtbaren Kooperation des Instituts für Radiobiologie der Bundeswehr mit zahlreichen militärischen und zivilen Partnern. Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.

Mein besonderer Dank gilt meinem Arbeitsgruppenleiter, Oberstarzt Prof. Dr. Michael Abend, der diese Arbeit mit seiner außerordentlichen konzeptionellen und fachlichen Kompetenz und seiner Vernetzung innerhalb der internationalen radiobiologischen Gemeinschaft erst ermöglicht und allzeit maßgeblich mitgestaltet hat.

Zitierweise:

Majewski M: Etablierung einer genexpressionsbasierten Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik der hämatologischen akuten Strahlenkrankheit. Wehrmedizinsche Monatsschrift 2019; 63(1): 2-10.


Verfasser
Oberstabsarzt Dr. Matthäus Majewski
Institut für Radiobiologie der Bundeswehr
Neuherbergstr. 11, 80937 München
E-Mail: matthaeusmajewski@bundeswehr.de


[1] Votum der zuständigen Ethik-Kommission: Siehe zweiter Absatz des Kapitels Material und Methoden.


[2] Votum der zuständigen Ethik-Kommission: Siehe zweiter Absatz des Kapitels Material und Methoden.


[3] METREPOL steht für Medical Treatment Protocols for Radiation Accident und wurde 2005 international als Basis für das medizinische Management Betroffener bei Strahlenunfällen definiert. In die Vorhersage des zu erwartenden Schweregrades einer Strahlenkrankheit gehen unter anderem hämatologische, neurovasculäre, cutane und gastrointestinale Symptome zu einem frühen Zeitpunkt nach Exposition ein (siehe auch [14]).


[4] ROC (Receiver Operating Characteristic) ist ein statistisches Verfahren, mit dem die diagnostische Qualität von Messverfahren mit binärem Ausgang (z. B. Laborparametern) bestimmt werden kann. Es werden die Sensitivität (Y-Achse) und die falsch positive Rate (X-Achse) dargestellt. Die Fläche unter der Kurve macht dabei eine Aussage über die diagnostische Genauigkeit des Verfahrens. Ein idealer Test ohne Fehlentscheidungen ergibt eine Fläche unter der Kurve von 1; ein rein auf Zufall basierendes Ergebnis würde zu einem Wert von 0,5 führen.


[5] STANAG = Standardization Agreement: In der NATO vereinbarter Standard für Verfahren, Methoden und Ausrüstung, der die Kompatibilität, insbesondere bei multinationalen Operationen, sicherstellen soll.



Datum: 22.02.2019

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